免疫金标记技术(研究生讲义) PPT课件

1,免疫金标记技术(Immunogoldlabellingtechique),2,免疫技术,3,标记免疫技术,放射性核素荧光素酶化学发光剂胶体金,4,金免疫测定技术金免疫组织化学染色技术,金免疫技术,斑点金免疫渗滤试验金免疫层析试验,金免疫光镜染色技术金免疫电镜染色技术,5,简介,胶体金颗粒具有高电子密度的特性，故在金标蛋白的抗原抗体结合处，显微镜下可见黑褐色颗粒；当这些标记物在相应的标记处大量聚集时，可在载体膜上呈现肉眼可见红色或粉红色斑点(线);从而用于抗原或抗体物质的定位或定性。,金免疫组织化学染色技术,金免疫测定技术,6,7,制备胶体金,制备免疫金,建立金免疫测定技术,8,胶体金的特性,胶体金（金溶胶）：是由金盐被还原成原子金后形成的金颗粒悬液。胶体金的特性胶体性质：稳定性、对电解质的敏感性光吸收性和呈色性：胶体金的光吸收峰波长随颗粒的大小而变化。稳定性：影响因素-电解质、溶胶浓度、温度、稳定剂,9,呈色性,不同大小的胶体金呈现不同的颜色小颗粒-橙黄色中等颗粒酒红色较大颗粒深红色大颗粒紫色,10,胶体性质,稳定性：稳定地、均匀地、呈单一分散状态悬浮于液体中,11,胶体金粒径（nm）,12,胶体金的制备,化学还原法:向一定浓度的金溶液内加入一定量的还原剂使金离子变成金原子,形成金颗粒悬液。还原材料：氯金酸（HAuCl4)还原剂：枸橼酸盐、白磷、硼氢化钠、维生素C。最常用的制备方法：枸橼酸盐还原法,13,操作要点配HAuC4水溶液加热沸枸橼酸三钠搅动加热沸（约23min*）冷却加蒸馏水至原体积*见淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸钠加入后很快变灰色，续而转成黑色，随后逐渐稳定成红色。,通过改变枸橼酸钠的用量可制得不同大小的胶体金颗粒,14,制备胶体金的注意事项（1）玻璃容器必须是最好是经硅化处理的。（2）氯金酸对金属有强烈的腐蚀性（3）氯金酸易潮解（4）制备胶体金应用或者是高质量的去离子水。,，不应使用金属药匙称量氯金酸。,双蒸/三蒸馏水，,绝对清洁的，,，应干燥、避光保存。,15,胶体金的鉴定和保存,鉴定1、清亮透明2、金颗粒的大小通过观察胶体金的颜色，粗略估计金颗粒的大小；分光光度计扫描max来估计金颗粒的粒径电镜观察保存保存于洁净的玻璃器皿中，室温或4C，加入少许防腐剂（如0.02NaN3）可有利于保存。,16,优质,劣质,17,免疫金的特性,-,+,胶体金,蛋白质,18,免疫金的制备,制备要点PH值的调整：原则上可选择待标记蛋白质等电点，也可略为偏碱蛋白质最适标记量的确定标记过程离心纯化：超速离心法免疫金最终用稀释液配成工作浓度保存：稳定剂-PEG，BSA,19,待标记蛋白作系列稀释+定量胶体金+Nacl最适标记量：能保持红色不变而蛋白含量最低的一管,蛋白量逐渐减低,对照管,20,金免疫测定技术固相膜免疫测定技术,固相载体：硝酸纤维素膜标志物：胶体金斑点金免疫渗滤试验（dotimmunogoldfiltrationassay,DIGFA），又称为滴金免疫测定法金免疫层析试验（goldimmunochromatographicassay,GICA）,21,斑点金免疫渗滤试验（dotimmunogoldfiltrationassay,DIGFA),加标本免疫金洗涤液,22,技术类型：夹心法、间接法,双抗体夹心法,23,间接法,24,质控,双抗体夹心法：相应抗原间接法：,人IgG,25,反应线,质控线,阳性,阴性,26,操作技术要点,27,金免疫层析试验（goldimmunochromatographicassay,GICA),G,T,C,28,夹心法竞争法(抑制法）间接法,金免疫层析试验（goldimmunochromatographicassay,GICA),双抗原夹心法双抗体夹心法,29,双抗体夹心法,G区：金标特异性抗体(兔型),C区：羊抗兔Ig,T区：特异性抗体,吸水纸,标本,阳性结果,30,竞争法,标本,G区：金标特异性抗体(兔型),C区：羊抗兔Ig,T区：标准抗原,吸水纸,阳性结果,31,标本,G区：金标特异性抗体(兔型),C区：羊抗兔Ig,T区：标准抗原,吸水纸,阴性结果,32,间接法反流免疫层析法,合上检测盒,窗(B),吸水材料(A),金标抗人IgG(G0),吸水材料(D),吸水材料(F),标本加样区(E),包被抗原（T）,标记线(G),液体流动方向,包被抗抗体（C）,33,标本,C,T,C,T,闭合前,闭合后,E,阳性结果,34,35,DIGFA与GICA的比较,36,IFA穿流（FLOWTHROUGH）ICA横流（LATERALFLOW）,37,免疫金标记技术的优势,示踪剂：以胶体金为指示剂，本身形成免疫分析过程后的颜色标记自带质控对照简便、快速：全部检测过程仅需3-20分钟。可单份检测稳定性好,38,免疫金标记技术的劣势,灵敏度不如酶标技术一般作为定性，不易定量。金标法在临床中的应用实例1：HBsAg的检测实例2：HCG的检测,39,金免疫组织化学技术,一、免疫金（银）光镜染色技术二、免疫金电镜染色技术,40,41,42,HBsAg诊断试剂,试剂盒参考图示,43,操作,步骤1：洗净双手,步骤2：用采血针采指尖血,步骤3：将1滴指尖血滴入加样孔，或者用吸管将1滴指尖血滴入加样孔,44,步骤4：立即加1-2滴缓冲