第八章克隆基因表达系统2014年

第八章克隆基因的表达,目的基因分离后，对研究者来说最重要的就是了解基因的功能。只有当一个基因能正常表达时，我们才能了解基因的内幕。,基因的表达:指遗传信息从DNA到RNA再到蛋白质的过程,一、影响外源基因表达的因素,1、阅读框架：指基因的编码区，包含从起始密码子至翻译终止密码子之间的cDNA序列。2、顺式作用元件顺式作用元件对基因转录起始的调控启动子增强子沉默子顺式作用元件对转录终止的调控终止子衰减子,启动子,是RNA聚合酶识别,结合并起始转录的一段DNA序列,长度随生物种类不同而异.主要特征:序列特异性:方向性:结构一般是不对称的，正反两个方向只有一种具有启动功能位置特异性种属特异性:,增强子,远距离调节启动子并提高转录效率的一段DNA序列,由多个元件组成,每个元件可与一种或多种转录调控因子结合.最早在SV40中发现,作用方式特点:双向作用提高转录效率无位置效应远距离作用组织特异性:只能在特定组织中增强与其相连的启动子的活性无基因特异性,沉默子,远距离调节启动子以降低转录效率的一段DNA序列,是调节基因表达的顺势作用负调控元件,最早在酿酒酵母中发现,终止子Terminator,为转录提供终止信号的一段DNA序列,是基因表达的顺势作用负调控元件.,衰减子,是原核生物基因表达调控的精细调节装置,是基因表达的负调控元件.,3翻译过程对表达的影响,翻译是mRNA指导多态链合成的过程,包括多态链合成的起始,延伸和终止过程翻译起始对基因表达的影响原核生物起始密码子(AUG),SD,SD序列与起始密码之间的距离保持在93个核苷酸;真核生物的5端帽子结构,起始密码子周边共有序列,有效的ORF是翻译所必需密码子偏爱的影响翻译终止的影响终止密码子对翻译的效率有很大影响.UAA,UAG,UGA,4表达系统对表达产物的影响,表达载体和受体细胞共同组成了外源基因的表达系统.,二、外源基因在原核细胞中的表达,(一)、原核生物基因表达的特点,只有一种RNA聚合酶，识别原核细胞的启动子，催化所有的RNA合成。以操纵子为单位，数个相关的结构基因与其调控区结合形成一个表达的协同单位转录和翻译偶联、连续进行。不含内含子，缺乏转录后的加工系统调控主要在转录水平上mRNA的核糖体结合位点上含有一个转译起始密码子及同16S核糖体RNA末端互补的序列,即Shine-Dalgarno（S-D）sequencemRNA上一段同核糖体16SRNA3末端碱基互补的序列，叫Shine-Dalgarno（S-D）序列,原核表达系统的注意事项,通过表达载体将外源基因导入宿主菌,并指导宿主菌酶系统合成外源蛋白外源基因不能带有内含子,必须用cDNA或全化学合成基因外源基因与表达载体连接后形成正确的开放阅读框架(openreadingframe)。必须利用原核细胞的调控原件（启动子等）防止外源基因产物对宿主细胞的毒害,(二)、原核生物基因表达的调控序列,原核生物基因表达的调控序列主要涉及启动子,S-D序列,终止子,衰减子等序列,1.原核生物启动子结构,启动子:是DNA上的能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列,是基因表达不可缺少的序列.保守序列-10区（Pribnow框）也称TATA-box,TATAAT-35区（Sextama框）TTGACA,是RNA聚合酶亚基的识别与结合位点,启动子,-35区序列,-10区序列,PrecA,Ptrp,Plac,PtraA,Ptac,启动子,TTGACA,GATACT,TTGATA,TATAAT,TTGACA,TTAACT,TAGACA,TAATGT,TTTACA,TATAAT,TTGACA,TATAAT,Ptac=3Ptrp=11Plac,PlL,乳糖启动子lac-来自大肠杆菌的乳糖操纵子色氨酸启动子trp-来自大肠杆菌的色氨酸操纵子PL和PR启动子-噬菌体中得到的一类启动子比lac启动子的活性高8-10倍，比trp启动子活性高.-10区顺序:GATAAT,-35区顺序:TGACTAtac启动子由trp和lac启动子人工构建的杂合启动子,2.Shine-Dalgarno（SD）序列,位于翻译起始密码子（AUG)上游5-13bp处的由3-9个bp组成的核苷酸序列富含嘌呤核苷酸，5UAAGGAGG3，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基中的16SrRNA3端区域3AUUCCUCC5并与之专一性结合，将mRNA定位于核糖体上，从而启动翻译；,核糖体结合位点对外源基因表达的影响,(1)SD序列的影响：一般来说，mRNA与核糖体的结合程度越强，翻译的起始效率就越高，而这种结合程度主要取决于SD序列与16SrRNA的碱基互补性，其中以GGAG四个碱基序列尤为重要。对多数基因而言，上述四个碱基中任何一个换成C或T，均会导致翻译效率大幅度降低,(2)SD序列与起始密码子之间的序列的影响SD序列下游的碱基若为AAAA或UUUU，翻译效率最高；而CCCC或GGGG的翻译效率则分别是最高值的50%和25%。紧邻AUG的前三个碱基成份对翻译起始也有影响，对于大肠杆菌b-半乳糖苷酶的mRNA而言，在这个位置上最佳的碱基组合是UAU或CUU，如果用UUC、UCA或AGG取代之，则酶的表达水平低20倍,(3)SD序列与起始密码子之间的距离的影响：SD序列与起始密码子之间的距离是影响mRNA转译成蛋白的主要因素之一。在很多情况下，SD序列位于AUG之前大约七个碱基处。在此间隔中少一个碱基或多一个碱基，均会导致翻译起始效率不同程度的降低,3.终止子结构,在一个基因的3端或是一个操纵子的3端往往有一特定的核苷酸序列,有终止转录的功能,这一序列称为转录终止子,简称终止子.转录终止过程包括:DNA聚合酶停留在DNA模板上不再前进，RNA的延伸停止；完成转录的RNA从RNA聚合酶上释放出来；RNA聚合酶从模板上释放出来。特点:有一段富含A/T的区域和一段富含G/C的区域,G/C区域又具有回文对称结构,转录后形成的RNA具有茎环结构,并且有与A/T富含区对应的一串U.,内在终止子（intrinsicterminator)依赖因子的终止子(-dependentterminator）,4.衰减子,指在某些前导序列中带有控制蛋白质合成速率的调节区。能够与mRNA作用形成独特的结构，终止转录。,原核生物的选择标记基因,Amp,Tet,St等,(三)、几种常用的原核表达载体,pkk233-3:非融合型表达蛋白载体；PINIII:分泌型克隆表达载体；pGEX:融合蛋白表达载体。,1.非融合型表达载体,载体表达出的外源基因蛋白质不与细菌的任何蛋白质融合在一起优点:产物结构接近于真核细胞体内的蛋白质结构,其表达产物的生物学功能也就更接近生物体内天然蛋白缺点:容易被细菌蛋白酶所破坏.如pKK223-3载体,S-D,P,结构基因,TAG,pKK223-3载体,强启动子:tac（trp-lac）操纵基因：乳糖操纵子系统。调节基因：宿主菌染色体上的乳糖操纵子系统，如JM105终止子：rrnB核糖体RNA的强终止子S-D序列和插入位点区载体的其余部分：来自pBR322质粒表达诱导物IPTG（乳糖的类似物，不会被降解）必须选择一个有lacI的宿主菌,2.分泌型表达载体-pINIII系列,除了在细胞内表达外，还可让表达的蛋白分泌到细胞外或细胞周质区中。这种表达方式可避免细胞内蛋白酶的降解，或使表达的蛋白正确折叠，或去除N-末端的甲硫氨酸，从而达到维护目标蛋白活性的目的。载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信号肽连在一起。,pINIII系列：pINIIIcomA1-3,强启动子：Ipp（脂蛋白基因启动子）和lacUV5启动子调节基因：lacIS-D序列和起始密码ATG分泌信号肽大肠杆菌外膜蛋白基因ompa插入位点区（多克隆位点）。Ipp-lac-lacO-S-D/ATGompa-插入位点pINIII-comA1以pBR322为基础构建的调节基因不必借助于宿主的lacI.,分泌型表达载体-pINIII-ompA1,lac,3.融合蛋白表达载体系统-pGEX系列,表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载体上的菌体蛋白连接在一起的。优点：可诱导高效表达载体内含有lacI阻遏蛋白基因融合蛋白的分离和纯化方便使用凝血酶和Xa因子可以从表达的融合蛋白中切下所需的蛋白质和多肽用EcoRI从rgt11载体中分离的基因可直接插入Pgex-1rT中,启动子：tac操纵基因：lacO，调节基因：lacIS-D序列，ori：pBR322ori，S-D下游融合肽：GST(谷胱甘肽巯基转移酶）lacI-Ptac-lacO-S-D/ATG-GST-基因插入位点-TGA,(五)、提高外源基因表达水平的策略,选择强启动子序列，如tac等调整S-D序列与AUG碱的距离，一般为5-9bp改变起始密码下面的几组密码子增加mRNA的拷贝数和稳定性减轻宿主细胞的代谢负荷提高表达产物的稳定性,减轻宿主细胞的代谢负荷,常用的方法有:诱导表达:使细菌的生长与外源基因的表达分开.一般用温度或药物诱导表达载体的诱导复制:将宿主菌的生长和表达质粒的复制分开,提高表达产物的稳定性,(1)克隆一段原核序列,表达融合蛋白融合蛋白:指表达的蛋白质或多肽N端由原核DNA编码,C末端由克隆的真核DNA的完整序列编码,这样表达的蛋白是由一条短的原核多肽和真核蛋白结合在一起,称为融合蛋白.去除原核蛋白的方法由:化学降解法和酶降解法.,(2)采用某种突变菌株,保护表达蛋白不被降解.如次黄嘌呤核苷缺陷型菌株做受体菌,使蛋白酶合成受阻.(3)表达分泌蛋白大肠杆菌主要由4部分组成:胞质,内膜,外膜及内外膜之间的周间质.分泌是指蛋白质从胞质跨过内膜进入周间质这一过程.,蛋白质在大肠杆菌中进行分泌必须具备的条件是:有一段信号肽;在成熟蛋白质内有适当的与分泌相关的氨基酸序列;细胞内具有相应的转运机制.信号肽:信号肽序列对于分泌蛋白质是必需的.长度一般为15-30个氨基酸,特点:(a)在氨基末端有一段带正点荷的氨基酸序列,往往是精氨酸或赖氨酸残基,数目为1-3个;(b)有一个疏水的核心区,含亮氨酸或异亮氨酸残基,位置可以从带正点荷的氨基酸延伸到含切割位点的区域;(c)含有能被信号肽酶水解的切割位点,这个位点常在丙氨酸之后或甘氨酸,丝氨酸之后.,二、外源基因在真核细胞中的表达,真核细胞做宿主表达系统的优点能够识别和除去外源基因中的内含子,剪接加工形成成熟的mRNA,包括5端加帽和3-端加尾真核细胞将表达的蛋白质糖基化缺点:选择标记及选择系统只有少数几个转化效率低,只有10-610-4外源基因转移并整合到细胞染色体DNA上带有一定的自发性和盲目性,整合的拷贝数和位置还不能控制细胞培养和细胞挑选的要求比较高,（一）、真核生物基因表达载体的组成特征,原核DNA序列启动子增强子剪接信号转录终止信号Poly(A)加尾信号,1原核DNA序列,真核生物的表达载体基本上都是在原核细胞和真核细胞之间的穿梭载体.能在大肠杆菌中自身复制的复制子及便于筛选含重组细菌的抗生素抗性基因和多克隆位点,2启动子,根据启动子功能和作用方式的不同，真核生物启动子分为：组成型启动子:在所有组织中都能持续启动基因的表达，表达产物量相对恒定。组织特异性启动子：在组织特异性启动子调控下的基因转录一般只发生在某些特定器官中，往往表现出发育调节的特性诱导型启动子：该类启动子在某些特定的物理、化学或生物刺激下，可以大幅度提高基因的转录水平。优点：根据需要在受体特定的发育阶段，组织或生长环境下，让其接受诱导信号，诱导目的基因的表达。如植物的光诱导启动子，热诱导启动子等。一个理想的可诱导表达系统要求：特异性；可诱导性；非干扰性;杂合启动子,3增强子,启动子和增强子联合应用可大大提高外源基因的转录水平。,4终止子,不同来源的终止子对外源基因的表达有很大影响，不仅决定外源基因的转录活性，也决定mRNA在细胞中的稳定性，从而影响mRNA的翻译。,5内含子,内含子可通过增加活性mRNA含量水平来促进基因的表达将蓖麻的过氧化氢酶基因的启动子插入到GUS后，可以使GUS的表达活性在水稻细胞中提高90倍。对植物转基因研究表明，内含子对基因表达的增强作用主要发生在单子叶植物。转基因动物的基因组DNA比cDNA表达水平高。,6polY(A)加尾信号,mRNA3末端的polyA尾可防止外切核酸酶对mRNA3末端的降解，增加mRNA稳定性。加尾信号需要3部分：多聚腺苷酸化序列：AAUAAA;剪切位点和加尾位点YA；下游保守序列，如U-rich.,7选择标记基因和报告基因是表达载体的重要组成元件，通常编码一种正常细胞中不存在的酶，对转化细胞的生长和分化不发生影响。,哺乳动物基因转移的选择标记,胸苷激酶（thymidinekinase,tk）基因二氢叶酸还原酶基因（DHFR）新霉素抗性基因（neor）氯霉素乙酰转移酶（CAT）chloramphenicolacetyltransferase次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸糖基转移酶基因(hgpt),酵母细胞于转化子筛选的标记基因,营养缺陷型的互补基因用于酵母菌转化子筛选的标记基因主要有营养缺陷型互补基因和显性基因两大类营养缺陷型互补基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基因，如：LEU、TRP、HIS、LYS、URA、ADE但对于多倍体酵母来说，筛选营养缺陷型的受体非常困难,植物常用选择基因,潮霉素(hpt)卡那霉素(kana),昆虫细胞,新霉素抗性基因(neor)博莱霉素Zeocin,起报告和识别作用，它的表达产物对受体细胞无毒性，可反映外源基因在受体细胞中的表达水平。大肠杆菌的-D-葡萄糖醛酸糖苷酶（-D-glucuronidase，GUS）；细菌和萤火虫的荧光素酶（luciferase）；水母绿色荧光蛋白（GFP）基因（GreenFluorescentProtein）其它,报道基因（reportergene）,几种报道基因的作用原理,GFP在紫外光照下发绿色荧光5-溴-4-氯-3-吲哚-D-葡糖醛酸+GUS-兰色水解产物当gus基因转入植物细胞内表达时，若与X葡萄糖苷酸酶（X-gluc，与X-gal相似），保温后，就会产生蓝色反应，借此可以预测报告基因的表达程度转入萤火虫的luciferase的烟草发荧光将昆虫荧光素和ATP表达荧光素酶的植物细胞混合，该酶催化昆虫荧光素的氧化反应，并生成AMP、CO2和光，表达该酶的植物细胞或组织便可用感光胶片检测。,（二）、真核表达的受体系统,酵母受体系统植物受体系统昆虫受体系统哺乳动物受体系统,酵母受体系统,酵母是一类单细胞的真核生物，生长代谢与原核生物相似，而基因表达与调控方面类似于高等生物，是最理想的真核生物外源基因