第九章DNA生物合成

第九章DNA的生物合成,学习目标,掌握：遗传信息传递的中心法则、复制和半保留复制、逆转录概念；参与DNA复制的酶、蛋白因子及其功能。熟悉：DNA复制特点、过程；端粒酶的概念与功能；DNA损伤（突变）的意义、类型，DNA损伤修复的方式。了解：双向复制、DNA复制的半不连续性概念；逆转录的过程。,主要内容,概述DNA的生物合成DNA的损伤与修复,概述,遗传信息传递的中心法则,反映了从DNARNA蛋白质的遗传信息主流，揭示了生物体内遗传信息的贮存、传递和表达的规律。,转录,RNA,翻译,蛋白质,DNA,RNA（病毒）,复制,复制,翻译,蛋白质（病毒）,反转录,第一节DNA的复制,定义：复制是指以亲代DNA为模板合成子链DNA的过程。,DNADNADNA复制,RNADNA反转录,DNA生物合成的两种方式,一、DNA复制的基本规律,复制的基本规律（特征）半保留复制半不连续复制双向复制复制的高保真性有起始点、终止点和方向,(一)DNA的半保留复制,1.定义：以亲代DNA双链为模板，以碱基互补方式合成子代DNA，这样新形成的子代DNA中，一条链来自亲代DNA，而另一条链则是新合成的，这种复制方式叫半保留复制。,2.半保留复制的实验证据:1958年Meselson和Stahl用同位素15N标记大肠杆菌DNA,首先证明了DNA的半保留复制。DNA复制的主要方式-DNA半保留复制,(蓝:15N),(棕:14N),DNA半保留复制的证据,新合成的链,3.DNA的半保留复制的生物学意义：,1.DNA的半保留复制表明DNA在代谢上的稳定性，是保证亲代的遗传信息稳定地传递给后代必要措施。2.DNA通过复制和基因表达这两种主要功能，决定了生物的特性和类型并体现了遗传过程的相对保守性。遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。,（二）半不连续复制,DNA双螺旋的两条链是反平行的，而DNA合成的方向只能是53。在DNA复制时，1条链的合成方向和复制叉的前进方向相同，可以连续复制，叫作前导链（leadingstrand）；而另一条链的合成方向和复制叉的前进方向正好相反，不能连续复制，只能分成几个片段（冈崎片段）合成，称之为滞后链（laggingstrand）。领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续复制。,（三）双向复制,复制时，DNA从起始点向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。原核生物染色体只有一个起始点，真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子(replicon)。复制子是独立完成复制的功能单位。,（四）复制的高保真性,DNA复制的精确度极高，误差率很低，以保证物种在维持遗传保守性的同时，还要通过变异不断进化。DNA复制的高度忠实性至少要依赖三种机制：1、遵守严格的碱基配对规律；2、DNA聚合酶在复制延长中对碱基的选择功能；3、复制出错时，DNA聚合酶的即时校读功能。,（五）复制的起始点与方向,亲代DNA开链，复制起始点呈叉型移动,复制起始点：DNA复制要从DNA分子的特定部位开始，此部位称复制起始点原核：一个起始点，约245bp,特殊的重复序列真核：多个起始点,ori,二、参与DNA复制的物质,1.模板：母链DNA（解开成单链）2.原料：dNTP(dATP、dGTPdCTP、dTTP)3.引物：小段RNA，提供3OH末端，使dNP可以依次聚合4.能量（ATP）及某些无机离子5.酶和蛋白质因子：,（1）DNA聚合酶即依赖于DNA的DNA聚合酶（DDDP）缩写：DNApol,原核生物迄今已知只有3种：DNApol、DNApol、DNApol。真核生物亦发现有多种DDDP：DDDP、。其性质与功能见表13-1和表13-2活性：1.53的聚合活性2.核酸外切酶活性,原料：四种脱氧核苷三磷酸（dATP、dGTPdCTPdTTP)需要模板：以DNA为模板链，合成子代DNA，模板可以是双链，也可以是单链DNA。合成产物与模板互补。需要引物：一小段RNA（或DNA）为引物，在大肠杆菌中，DNA的合成需要一段RNA链作为引物，引物含3-OH.合成方向：53,DNA聚合酶：催化性质如下：,大肠杆菌中DNA聚合酶某些性质DNA聚合酶性质-酶分子/细胞4004020酶分子量(kd)1099014053聚合功能有有有53外切酶活性有有无35外切酶活性有有有聚合核苷酸数/分钟/分子(37)10005015000主要功能修复等修复作用复制,真核细胞中DNA聚合酶的性质DNA聚合酶性质-分布细胞核细胞核线粒体细胞核细胞核分子量(kd)25036-38160-30017025635外切酶活性无无有有有53聚合作用有有有有有主要功能复制损伤修复复制复制复制损伤修复(随从链)(领头链),（2）引物酶,RNA的合成：需引物酶，它是一种特殊的RNA聚合酶。,DNA不能从无有合成，需在一小段RNA基础上合成DNA,（3）解链酶(又称解螺旋酶或螺旋酶),作用：断裂互补碱基间的氢键,使DNA双链分离形成“复制叉”。,（4）拓扑异构酶（Topo）,DNA拓扑异构酶，改变DNA分子构象，理顺DNA链，使复制能顺利进行。作用特点：对DNA分子的作用是既能水解，又能连接磷酸二酯键。DNA分子一边解链，一边复制，拓扑酶是在复制全过程中都是有作用的。分类：拓扑酶和拓扑酶,Topo(又称旋转酶)的作用：无ATP时：作用相当于Topo,但切割的是双链DNA某一部位(断双链)。有ATP时：使带断口、松弛状的DNA分子旋紧转变成负超螺旋结构，再连接断端。,Topo的作用：不需耗能(ATP)，切割(断)双链DNA中的一链，松解螺旋,封闭切口。又称切割封口酶。,作用机制,（5）单链DNA结合蛋白(DNA结合蛋白)(SSB),作用：防止重新形成双链和防止单链模板被核酸酶水解,维持DNA单链状态和完整性,作用：在有模板指导的条件下，催化2个DN片段(两片段间的距离为1个3,5-磷酸二酯键的键长)的连接。原理：在一个DNA片段的3-OH末端和另一个DNA片段的5-P末端形成3,5-磷酸二酯键，从而实现连接。特点：原核细胞:需辅助因子NAD+真核细胞:不需辅助因子NAD+,但需耗能(ATP),（6）DNA连接酶,参与DNA复制的酶及蛋白质酶或蛋白质主要作用拓扑异构酶类克服解链时打结及缠绕、松驰或引进负超螺旋解链酶类解开DNA双链单链DNA结合蛋白维持已解开单链DNA的稳定引物酶合成RNA引物DNA聚合酶DNA复制DNA聚合酶水解引物、填补空隙、修复作用DNA连接酶催化双链DNA中单链缺口的连接,三、复制的化学反应,复制是酶参与下的核苷酸聚合过程，需要多种生物分子共同参与。核苷酸与核苷酸之间生成3，5磷酸二酯键而聚合，是复制的基本化学反应。反应底物是dNTP，加入子链的是dNMP。反应可简示为：（dNMP）n+dNTP（dNMP）n+1+PPi,四、DNA的复制过程大致分为三阶段：复制的起始链的延长复制的终止,（一）复制的起始,1.DNA解成单链由特定蛋白质识别复制起始位点（ori）解螺旋酶、TOPO酶及单链DNA结合蛋白的共同作用下，DNA解链，解旋，形成复制叉2.引发体的生成解旋酶解开双链后引物酶进入形成引发体3.RNA引物的合成依赖于单链模板，由引物酶催化按碱基配对规律合成一小段RNA引物(原核细胞引物长50-100个碱基，真核约10个碱基)。,复制起始阶段的特点,真核细胞：具有多个起始位点,原核细胞：仅有一个复制起始位点，但往往是双向复制,（二）链的延长,引物合成后，由DNApol（真核细胞为DNA聚合酶或)催化，在引物3-OH末端逐一添加与模板链对应互补的脱氧核苷磷酸,使新合成的链不断延长。3AAGACCTATT55TTCTGGATAA3领头链:链的延长方向(53)与解链方向(复制叉移动方向)相同,为连续合成。随从链:链的延长方向(53)与解链方向(复制叉移动方向)相反，为不连续合成冈崎片段：分段合成的DNA片段半不连续性：DNA复制过程中，一条链是连续复制，另一条链是不连续复制的现象,延长,冈崎片断,复制延长简图,（三）复制的终止,1.水解引物及填补空隙冈崎片段合成后，由DNApol(真核细胞可能是DNA聚合酶)水解去除RNA引物，并填补留下的空隙(53)聚合。2.完整双链DNA分子的形成填补空隙后，DNA片段与片段之间还有一个缺口(一个3,5-磷酸二酯键的长度),由DNA连接酶催化连接成完整的链，从而产生完整的双链DNA分子。,DNA复制过程总结如下,（1）辨认起始点特异的蛋白可以在DNA模板上辨认DNA复制的起始点。由此启动，开始合成RNA引物。RNA聚合酶有辨认起始点的作用。（2）DNA的解链由DNA旋转酶和解链酶协同作用，使DNA双链松弛并使氢键局部解开。（3）RNA引物的生成以DNA为模板，在DNA指导的RNA聚合酶催化下，合成由50100个核苷酸组成的短段RNA，合成方向由53。,辨认起点、解旋解链、合成引物、复制片段、切除引物、连成长链,（4）在RNA引物上合成DNA首先，以DNA双链中35方向的链为模板，在引物RNA的3端连续地合成其互补链，此为前导链。同时，以DNA双链的另一链为模板，在若干RNA引物的3端合成冈崎片段。（5）RNA引物的脱落和补缺口DNA聚合酶I催化（由53外切）切除引物。切除RNA引物的部位，按碱基互补原则，沿53方向用与模板互补的脱氧核苷酸残基填满，完成冈崎片段的延长。（6）冈崎片段连接在连接酶的作用下将相邻的DNA片段以3，5磷酸二酯键连接起来形成滞后链。,DNA复制的精确性（高保真复制）,1、碱基的配对规律：摸板链与新生链之间的碱基配对保证碱基配错几率约为1/1041/105。2、DNA聚合酶的35外切酶活性的校对功能，使碱基的错配几率又降低1001000倍。3、DNA的损伤修复系统。,DNA复制必须具有高度精确性，在大肠杆菌的细胞DNA复制中其错误率约为1/1091/1010，即每1091010个核苷酸才出现一个错误，也就是大肠杆菌染色体DNA复制100010000次才出现一个核苷酸的错误。这么高的精确性的保证主要与下列因素有关：,第二节反转录,一、逆转录概念及逆转录酶定义：以RNA为模板，dNTP为原料，反转录酶催化，按碱基配对规律合成DNA的过程。反转录酶,又称为依赖RNA的DNA聚合酶(RDDP),DNA,RNA,RNA(病毒),病毒RNA,RNA-DNA杂化分子,cDNA,前病毒(双链DNA),二、逆转录的过程,(一)逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现，发展了中心法则。(二)逆转录现象说明至少在某些生物，RNA同样兼有遗传信息传代与表达功能。(三)对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意到的病毒致癌理论。,三、反转录的医学意义,第三节DNA的损伤与修复,一、DNA损伤（突变）,突变(Mutation)是指DNA分子中碱基序列的改变，又称为DNA损伤(DNAdamage)。,概念,UV,（一）引起DNA损伤的因素,1.物理因素紫外线(常产生嘧啶二聚体)电离辐射(断磷酸二酯键),胸腺嘧啶二聚体的产生,2.化学因素：均能干扰复制与转录功能,烷化剂：(如氮芥类,CTX)，使鸟嘌呤的N7烷基化后脱落，成为无鸟嘌呤的位点,亚硝酸盐：使碱基脱氨,原G-C配对最终变为A-T配对，导致错配,CU,AI,GX,丝裂霉素：与DNA共价连接引起链交联,3.生物因素目前多指病毒4.生理因素（自发因素）机率极低糖苷键自行断裂；自发脱氨基作用,CU，AI。,（二）基因突变可能出现的意义及类型意义：1.突变是进化、分化的分子基础2.突变导致基因型改变3.突变导致死亡4.突变是某些疾病的发病基础,缺失插入,点突变,缺失或插入的碱基数不是3的整倍数时，则引起移码突变(框移),重排DNA分子内较大片段的交换(重组),颠换：异型碱基间变异,转换：同型碱基间变异,3.突变类型（1）根据引发的原因，可将突变分为2类：诱发突变和自发突变。（2）根据DNA分子的改变，突变可分为4类：,(错配),修复(repairing)：是对已发生分子改变的补偿措施，使其回复原有的天然状态。,（三）DNA损伤的修复,T+T,DNA修复方式,1.光修复:,光修复过程是通过光修复酶催化而完成的，仅需300600nm波长照射即可活化，普遍存在于各种生物，人体细胞中也有发现。紫外光照射可使相邻的两个T形成二聚体。光修复酶可使二聚体解聚为单体状态，DNA完全恢复正常。,2.切除修复：由3种酶共同参与完成，是细胞内最重要的修复机制。全过