考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度含(-Bradford-法)概要PPT课件

.,1,蛋白质含量的测定,考马斯亮蓝染色法（Bradford法）,实验人员：董佳琦潘立,.,2,一、实验目的掌握Brodford法测量蛋白质浓度的原理和操作技术。,.,3,二、实验原理,考马斯亮蓝法是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的，这是一种迅速，可靠的通过染色法测定溶液中蛋白质浓度的方法。尽管相对于其他方法来说，此法的干扰物较少，但由于每种蛋白质与该染料的结合能力不同，故标准品的选择非常重要，选择尽可能与待测蛋白一致的样品做标准，能最大限度的提高该方法的准确性。,.,4,考马斯亮蓝G250有红蓝两种不同颜色的形式。在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色的溶液，当与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳定。经研究证明，染料主要是蛋白质中碱性氨基酸和芳香族氨基酸残基相结合。反应化合物在595nm处有最大光吸收，化合物颜色的深浅在一定范围内与蛋白质浓度成正比，因此可通过测定595nm处的光吸收值来计算蛋白的含量。,.,5,考马斯亮蓝染色法的优点：（1）灵敏度高（比Lowry法灵敏4倍），测其最低蛋白质测量可达1mg。(2)测定快速,简洁。只需加入一种试剂，完成一个样品的测定，只需5min左右。(3)此方法干扰物少如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg+例子，Tris缓冲液、蔗糖、甘油、EDTA等均不干扰此法。,.,6,考马斯亮蓝染色法的缺点：1.由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此Bradford法用于不同蛋白质时有较大的偏差。在制作曲线时通常选用G-球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。2.仍然有一些物质干扰此法的测定。主要干扰物质有：去污剂TritonX-100,SDS和0.1mol/L的NaOH3.标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定蛋白质的浓度。,.,7,三、试剂和器材,1、试剂（1）考马斯亮蓝G250燃料试剂考马斯亮蓝G-250100mg溶于50ml95%乙醇中，加入120ml85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml。（2）标准蛋白质溶液称取BSA50mg，以0.015mol/L的PBS溶液50mL溶解，配制成1.0mg/mL的标准蛋白质溶液，4存放。,.,8,2器材,（1）取样器及其架子（2）试管及试管架（3）漩涡混合器（4）微量进样器（5）VIS-7220可见分光光度计,.,9,四、操作方法1、标准曲线的制作,（1）取7支试管，1号管为空白，2-7号用微量进样器分别加1.0mg/mL的牛血清白蛋白溶液10，20，40，60，80，100L，各管用0.015mol/LPBS缓冲液补充剂100L，详见下表，混匀待用,.,10,.,11,另取3支清洁试管，编号8、9、10，用微量进样器按下表操作，将待测蛋白配成系列浓度。,2、将待测蛋白配成合适浓度,.,12,.,13,各试管充分混匀后，用取样器分别加入5.0mL考马斯亮蓝G250试剂，每加完一管，立即混合。,3、加入G250试剂,.,14,各管室温静置2-5min后，在分光光度计上测定595nm处的光吸收值A595，空白对照为1号试管，标准和待测蛋白同时比色。注意：不可使用石英比色皿，只能用玻璃比色皿，使用后立即用少量95%乙醇润洗，洗去颜色。,4、比色,.,15,以标准蛋白质浓度（mg/mL）为横坐标，吸光度A595为纵坐标作图，得到一条标准曲线。,5、制作标准曲线,.,16,在标准曲线上，根据测出的待测样品的A595值，查处试管中蛋白质浓度，再按照计算公式：待测蛋白质的浓度（mg/mL）=查出的浓度稀释倍数计算出待测蛋白浓度，如样品稀释合理且操作得当，待测蛋白的三个数值应具有同一性，取其平均值作为待测蛋白浓度，如某一吸收值落在标准曲线线性范围外，舍弃该点。,6、根据标准曲线计算待测蛋白浓度,.,17,五.计算六.注意事项1.蛋白质反应液应该储存在棕色瓶内，可长期使用，但如果变为绿色，则需要重配2.比色皿只能用自来水冲洗，蒸馏水、95%乙醇润洗，不可用试管刷或者其他物品直接洗刷。3.玻璃比色皿1套只有4只，可以同时使用，严禁与其他比色皿混用。4.分光光度计的吸光值在0.2-0.7时准确度最高，低于0.1而超出0.1时误差较大，如未知样品的读数不在此范围内，应将样品做适当稀释或浓缩。,.,18,七.补充蛋白质含量测定方法比较蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Folin酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford法）。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏1020倍，比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。,.,19,值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。在选择方法时应考虑：实验对测定所要求的灵敏度和精确度；蛋白质的性质；溶液中存在的干扰物质；测定所要花费的时间。考马斯亮蓝法（Bradford