分离分析法导论.ppt

一、色谱分析法及其基本概念,1、色谱法的发展,1906年，俄植物学家M.Tswett分离植物色素,DevelopingofChromatographicTechnique,1948,8daysseparationfor16aminoacids,DevelopingofChromatographicTechnique,1958,22hoursseparationfor19ofaminoacids,DevelopingofChromatographicTechnique,1982,lessthan30minutesseparationfor18ofaminoacids,2、色谱法分类,（1）按流动相和固定相所处状态分,气相色谱（GC）气液色谱（固定相为固定液，即固定相是附着在惰性载体上的一薄层有机化合物液体）气固色谱（固定相是固体吸附剂）液相色谱（LC）液液色谱液固色谱,（3）按分离原理分,吸附色谱（利用组分在固定相上的吸附能力强弱不同而得以分离的方法）分配色谱（利用组分在（固定相）中溶解度不同而达到分离的方法称为分配色谱法）离子交换色谱（利用组分在离子交换剂（固定相）上的亲和力大小不同而达到分离的方法）排阻色谱（利用大小不同的分子在多孔固定相中的选择渗透而达到分离的方法，又称凝胶色谱法）,3、色谱图及常用术语,（1）色谱图：试样各组分经色谱分离后，从柱后流出进入检测器，检测器将各组分浓度（或质量）的变化转换为电信号（电压或电流），再由记录仪记录下来，所得的电信号强度随时间变化的曲线，即为流出曲线，也称为色谱图，曲线上突起部分就是色谱峰。,（2）常用术语,基线：柱中只有流动相流过时，检测器的响应信号记录值，稳定的直线应是一条水平直线。,峰高h：色谱峰顶点与基线的垂直距离峰宽：峰底宽Y半峰宽：1/2h处的峰宽，Y1/2标准偏差：0.607h处的峰宽为2峰面积：,保留值：表示试样中各组分在色谱柱内停留状况的指标，反映组分分子与固定相分子间作用力的大小，通常用时间和流动相的体积表示。,用体积表示的保留值（单位：mL）死体积（V0）：不被固定相保留的组分，通过色谱柱所消耗的流动相体积，由死时间确定保留体积（VR）：试样从进样到出现最大峰所通过的流动相体积调整保留体积（VR）：VR=VR-V0,（3）分配平衡,样品组分在固定相与流动相之间进行多次分配使其得到分离。,样品在固定相与流动相之间进行分配，很快达到平衡，即分配平衡。当流动相流过时，样品将在流动相和新的固定相中又达到分配平衡，同时原来仍在固定相中的样品与新的流动相之间也会形成新的分配平衡，随着流动相的不断流过，它们携带发生分配平衡后仍存在于流动相中的样品沿着柱子向前流动，从而达到不同组分分离的目的。,色谱分离原理及分离参数,分配比影响因素：组分、流动相和固定相的热力学性质；温度和压力等因素；流动相及固定相的体积。,分配系数影响因素：组分、流动相和固定相的热力学性质；温度和压力等因素。,（组分在固定相中的量越多，相当于柱的容量大，因此分配比又称分配容量或容量因子）,A,B组分未分离,A,B组分分离不完全,A,B组分分离完全,二、色谱分析法基本理论,两组分的分配系数有差异区域扩散速率小于区域分离速率,塔板理论速率理论,1、塔板理论,结论：n与半峰宽及峰底宽的关系n大于50，可得到峰形基本对称的曲线只要被分离组分K有差异，只要n足够大，经过反复多次的分配后均可进行分离,假设：（1）色谱由一系列连续的，相等的水平塔板组成，每一塔板高度为H，理论塔板数n=L/H（2）在每一塔板内，组分可在两相间迅速达到平衡（3）流动相进入是间歇的，而非连续，每次进入为一个塔板体积（4）所有组分开始存在于0号塔板上，而且试样沿纵向扩散不计（5）分配系数K恒定不变,理论优点：解释了流出曲线的形状，提出了计算和评价柱效能高低的因素（n）如果若tR一定，那么n越大，H越小，则色谱峰越窄，柱效能越高。理论缺点：（1）色谱过纵向扩散等不能忽略，（2）塔板理论只能定性地给出板高的概念，不能解释板高受哪些因素影响，无法提出降低塔板高度的方法（3）不能说明为什么在不同的流速下，可以测得不同的理论塔板数（4）分配系数与浓度无关只能在有限的浓度范围内成立（5）色谱柱中没有真正的平衡体系,2、速率理论,1956年，荷兰，范弟姆特，速率理论,A：涡流扩散项系数，B：分子扩散项系数，C：传质项系数，u：平均流速,A，B，C越小，H越小，n越大，柱效高A，B，C越大，H越大，n越小，柱效低,A-涡流扩散项,由于流动相流经填充物的不规则空隙时，其流动方向改变，形成紊乱的类似“涡流”的流动而引起,涡流扩散过程示意图,B/u-分子扩散项（纵向扩散项）,样品在纵向上的浓度梯度而造成的扩散,影响因素：弯曲因子。填充柱中由于固定相颗粒的存在，使分子自由扩散受到阻碍，扩散程度降低，1；空心毛细管柱=1。Dg：组分分子在其气相中的扩散系数。组分分子量大，柱温高，柱压大，载气分子量大，Dg小；反之则大。u：流动相平均线速，纵向扩散与组分在色谱柱内停留时间有关，流动相流速小，组分停留时间长，纵向扩散就大。结论：采用分子量较大的载气，较高的载气流速，控制较低的温度，可使分子扩散项系数减小,C-传质阻力项,物质迁移过程中存在的阻力,Cm：流动相传质阻力项系数，即为待测试样组分从流动相移动到固定相表面的进行分配时所受到的阻力,影响因素：容量因子k，填充物平均直径dp，组分在气相中的扩散系数Dg结论：采用颗粒小的填充物，及分子量小的载气,范氏方程,总的影响因素：填充物的均匀程度，填充物粒度的大小，流动相的种类和线速，固定相的液膜厚度,柱效：色谱分离的动力学因素，由理论塔板数来衡量。如果若tR一定，那么n越大，H越小，则色谱峰越窄，柱效能越高。选择性：两峰间的距离衡量色谱的选择性，距离越大选择性越好，一般以表示,3、色谱分离效能的衡量,分离度,分离度概念：又叫分辨率或分辨度，色谱峰中相邻两峰分离程度的量度，是相邻两峰保留值之差与两峰峰底宽的平均值之比。,R值越大，表明相邻两组分分离越好Rs1.5，两峰完全分离(分离程度可达99.7%),n越大，R越大n=L/H，(R1/R2)2=n1/n2=L1/L2增加柱长的色谱柱可以提高分离度，但延长了分析时间。制备一根性能优良的柱子，通过降低板高，以提高分离度。,（1）分离度与柱效的关系,已知物质A和B在一根30.00cm长的柱上的保留时间分别为16.40min和17.63min。不被保留组分通过该柱的时间为1.30min。峰底宽度分别为1.11min和1.21min，计算：（1）柱的分离度；（2）柱的平均塔板数；（3）达到1.5分离度所需的柱长度。,解：（1）柱的分离度R=2（17.63-16.40）/（1.11+1.21）=1.06（2）柱的平均塔板数n=16(16.40/1.11)2=3493n=16(17.63/1.21)2=3397n平均=（3493+3397）/2=3445（3）达到1.5分离度所需的柱长度R1/R2=(n1/n2)1/2n2=3445(1.5/1.06)2=6898L=nH=6898(300/3445)=60cm,三、色谱的定性分析和定量分析,与标样对照的方法保留值法（单柱法和双柱法）相对保留值法已知物的峰高加入法,1、色谱定性方法,利用保留指数法定性,方法：分别测出待测物质i与基准物质s的调整保留值，求出相对保留值ris，将ris与文献值比较后定性。基准物质通常选容易得到纯品的，且与被分析组分相近的物质，如正丁（戊）烷、环己烷（醇、酮）、苯、对二甲苯等。优点：ris仅随固定液及柱温变化，与其它操作条件无关。,方法：首先作出未知物样品的色谱图，然后在未知物样品中加入某已知物，又得一色谱图，峰高增加的组分即可能为这种组分。优点：当未知样品中组分较多，所得色谱峰过密，用上述方法不易辨认时，或仅作未知样品指定项目分析时均可用此法。,例：确定物质i在某固定液X上的保留指数IiX的数值。,tR(Z+1),保留指数定性法（柯瓦指数）,优点：保留指数计算准确，准确度高，值仅与柱温和固定相有关,利用质谱定性,基本原理：质谱分析是将样品转化为运动的带电气态离子碎片，于磁场中按质荷比(m/z)大小分离并记录的分析方法。,分子离子,碎片离子,重排裂解,碰撞裂解,2、色谱定量分析,定量分析基础：待测组分的质量或浓度与色谱峰的峰面积或峰高成正比,定量分析步骤：准确测量检测器的响应信号峰面积或峰高；峰高乘以半峰宽法A=1.065hY1/2峰高乘以平均峰宽法A=1/2h(Y0.15+Y0.85)剪纸称重法自动积分法准确求得比例常数校正因子；正确选择合适的定量计算方法，将测得的峰面积或峰高换算为组分的百分含量。,（1）校正因子,绝对校正因子,相对校正因子：组分i与标准物质s的绝对校正因子之比。,fi值由文献中得，也可以自己测定。常用的标准物质是苯和正庚烷。,面积校正因子,峰高校正因子,（2）定量方法,归一化法；内标法；外标法,优点：简单、准确、受操作条件影响小缺点：样品中组分必须全部都有可测量的色谱峰；测量低含量或微量物质时误差较大,m为待测物质质量，wi为组分i在试样总量中所占的比例,归一化法：所有出峰组分的含量之和按100%计的定量方法。,内标法：将一定量的纯物质作为内标物加入到准确称量的试样中，根据试样和内标物的质量以及被测组分和内标物的峰面积或峰高求出组分的含量,m为待测物质质量，wi为组分i在试样总量中所占的比例,内标物要求：试样中不存在性质与被测物相近，能完全溶于样品中，但不与样品反应内标物的峰与试样各组分的峰完全分开，且尽可能与待测组分峰接近内