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文档简介

.,共聚焦显微镜应用,细胞原位检测核酸,.,目录,概述PI的特性PI的应用PI标记细胞的方法,.,概述,激光扫描共聚焦显微术通过成像显示出细胞内核酸的分布特征及含量，即实现定位、定性及定量检测核酸。该方法常用于细胞核定位及其形态学观察、检测细胞内DNA的复制及断裂情况以及染色体定位观察等。,.,荧光探针分子与核酸结合方式,嵌入性结合方式嵌入在DNA的两个碱基之间，每隔几个碱基嵌入一个荧光分子结构亲和方式以静电力结合，正电荷荧光分子和带负电和的磷酸互相结合，极弱，常造成荧光分子丢失共价键方式使DNA链之间以原子结合的方式被打开，形成与荧光探针分子共价结合,.,碘化丙啶（PI）检测核酸,PI的特性PI属于嵌入性荧光探针，可以嵌入到双链DNA和RNA碱基对中与之结合，无碱基特异性。这种结合方式紧密，稳定。通常，PI染色可以同时标记双链DNA和RNA的总和；经过RNA酶处理除去RNA的干扰后，可定性和定量DNA。PI另一特点是不能进入完整的细胞膜，因此用于检测细胞的死活,.,PI应用,PI标记可以是活细胞也可以是固定的细胞当标记活细胞样品时，目的在于检查细胞的膜完整性及其坏死情况，常应用于检测膜损伤、细胞凋亡；标记固定细胞时，目的一般是进行细胞核定位、显示细胞核或染色体的形态、定量测定核酸等，常应用于检测细胞周期、细胞凋亡、RNA和DNA在细胞内的分布及其含量变化、以及用作核酸显色剂,.,PI标记细胞的方法,样品为活细胞可直接向细胞外液中加人PI,使终浓度为115g/ml（根据细胞种类及其密度而异），室温放置515min后，用激光扫描共聚焦显微镜检测。细胞膜完好的正常活细胞，PI不能染色；膜不完整的细胞及死细胞则可检测到PI的红色荧光，此时观察到的是细胞内DNA和RNA的总量。该项检测最好在短时间内完成，因PI也有一定的细胞毒性，长时间接触会损伤正常活细胞而进人细胞内，造成实验假象,.,PI标记细胞的方法,样品为固定细胞用含有PI110g/ml的PBS染色液（pH为7.27.4）标记，室温标记515min，上机测定。若只要检测细胞内DNA时，则在上述染色前还需要加人浓度为50g/ml的RNA酶，然后在37孵育30分钟，以消化去除RNA,即可进行PI染色和DNA观察分析,.,谢谢聆听,未完待续,.,楚河汉界,小鼠肠道及其中的人类肠道微生物，6
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