P53基因突变检测方法.doc

2、试剂和耗材QIAampDNA Blood Mini Kit（GIAGEN，德国)PlatinumTaq DNA Polymerase High Fidelity（Invitrogen,11304-102）Nuclease-Free Water (Promega,P1195) d NTP Mix (Promega,P151B) PCR引物：北京博迈德科技有限公司合成 DNA分子定量标准：DL10000 DNA Marker(TAKARA,大连宝生物) PCR产物回收纯化试剂盒（BioSpin Gel Extraction kit，日本Bioer技术有限公司）0.510 l、220 l、20200 l、2001000 l吸头（美国Axygen，公司）EP管3、仪器Tannon1600R凝胶成像系统分析仪（上海天龙公司）；Eppendorf 5417R高速冷冻离心机（Eppendorf公司，德国）Allegra 6R离心机（Beckman-Coulter公司，美国）MVS-1型涡旋混合器（北京北德科学仪器厂）移液器2 l、10 l、50 l、200 l、1000l（Eppendorf公司，德国）级生物安全柜NU425-400E（NEWAIR公司，美国）X-15R高速冷冻离心机（BECKMAN COULTER公司，美国）Eppendorf Mastercycter PCR仪（Eppendorf 公司德国）电泳仪：Universal 024BR（Bio-Rad公司，美国）电热恒温水浴器（北京来亨科贸有限责任公司）凝胶成像分析系统：Tocan 240全自动凝胶成像系统（中国）测序仪：GenomeLab CEQ/GeXP（BECKMAN COULTER公司，美国）20l、200l和1000l加样器（吉尔森公司，法国）旋涡震荡器（Scientific Industries公司，美国）二、实验方法1、样品采集，送检和保存 乙二胺四乙酸（EDTA）-3K抗凝管采集HIV和HBV合并感染者外周静脉血，于24 h内测定CD4+T淋巴细胞计数，抗凝血经常规离心分离全血中间层，分装后-80冻存用于P53基因变异的测定。2、血浆样本DNA的提取取200 l 全血中间层于1.5ml 无菌EP管中，加入20l蛋白酶K；再加入200l AL缓冲液，涡旋振荡15秒，56孵育10分钟；瞬时离心EP管，加入200l无水乙醇，涡旋振荡15秒，再瞬时离心收集管壁残液；将上述混合液加入到QIAMP离心柱中，6000g离心1分钟，弃去含废液的收集管，更换新的废液收集管，注意不要让离心柱沾染废液；离心柱中加入500l缓冲液AW1，6000g离心1分钟，弃去含废液的收集管，更换新的废液收集管；离心柱中加入500l 缓冲液AW2，20000g离心3分钟，弃去含废液的收集管，更换新的废液收集管； 20000g离心1分钟，弃去含废液的收集管，将离心柱插入1.5ml无菌EP管中，在离心柱中加入200l 洗脱液AE（事先预热至70），室温孵育1分钟后，6000g离心1分钟，EP管中收集的即为目标DNA；0.7%TAE-琼脂糖凝胶电泳，验证DNA 提取质量，-20保存备用。3、PCR扩增P53序列使用引物如下：名称方向核苷酸组成Primer15外侧cttgccacaggtctccccaaPrimer23外侧aggggtcagaggcaagcaga反应体系（50ul）组分体积（l）10PCR 反应缓冲液5dNTP（2.5mM） 5Primer1-forward (20uM )1Primer2-reverse (20uM )1Promega Taq (5U/l) 0.5DNase/RNase free water32.5提取的DNA5Total volume50PCR反应条件：95 变性30秒，55退火30秒，72 延伸90秒，28个循环；4、PCR反应产物纯化取终产物5l进行1%琼脂糖凝胶电泳(含溴化乙啶0.5g/ml) ，100V电泳40 min，经Ultra-Violet Product 凝胶成像后与marker比对，确认所需片段250bp，用QIAquick Gel Extraction Kit试剂盒纯化基因片段。5、PCR反应产物测序将PCR 反应产物切胶回收， 使用BECKMAN 公司的GEXP系统测序GenomeLab CEQ/GeXP遗传分析系统测序分析实验步骤： 1，配置测序PCR反应试剂：总体积 20ul 10ul纯水(补足至总体积) 0-9.5ul 0-3.5ul模板 (用量见附表) 0.5-10ul 0.5-4ul引物(5pmol/ul) 1ul 1ulDTCS Mix 8ul 4ul质粒DNA模板的热处理: (线性DNA模板,如果为PCR产物无需加热)；在热循环仪上加热 DNA模板和水: 96C 1-3Min；自然凉到室温后再加入其它组分； 2，热循环反应，程序如下：1、 96 C 20sec2、 50 C 20sec3、 60 C 4min Back to step 1, for 30 cycles.4、 4 C Holding 3、终止反应a, 按照NaOAC：EDTA：Glycogen = 1：1：0.5准备测序反应终止液（即用即配，低温放置）；b, 取出测序反应产物，稍微离心；按照2.5ul/10ul向测序反应产物加入反应终止液。 4、乙醇沉淀a, 每个反应管中加入30ul 95%冰乙醇/10ul Reaction；轻混匀，离心（4 C，14000rcf，15min），去上清；b, 加100ul 70%冰乙醇洗脱残留盐，离心（4 C，12000rcf，5min）,去上清；c, 再次加100ul 70%冰乙醇洗脱残留的盐，离心（4 C，12000rcf，5min），去上清；d, 低速离心10S，用Tip头吸干残留液体，37C避光干燥，35 Min。e, 在每个样品管中加入20ul SLS, 反复吹打DNA沉淀（10-20次），静置3min，稍微离心； 5、CEQ上样a, 小心转移样品至CEQ 样品板(不要出现气泡), 加一滴石蜡油覆盖样品；b, 在缓冲液板孔内加入3/4体积的测序缓冲液；上机进行测序反应ABI 3500测序一 、实验试剂和耗材准备：（一） 实验试剂：纯化好的PCR产物，测序引物，Bigdye v3.1, ddH2O，POP7胶， Sequence Standard(3130), 5Buffer, HiDi（二） 实验耗材：96孔板，0.2EP管，移液枪，计时器，记号笔二、实验操作具体步骤：（一）测序反应体系（标准）：DNA（35ng/ul） 6ul引物（20pmol/ul）1ulddH2O 8ulBigdye 2ul5Buffer 3ul总体积 20ul测序PCR循环条件：961 min（96 10sec, 505sec,604min）x25循环4 保温（二） 测序产物纯化（酒精/EDTA法纯化）：1 每管加入5 ul 125mM EDTA, 加到管底；2 加入60ul100%酒精，封严，震荡4次，室温放置15min;3 3000g 4离心30min，马上倒置96孔板，185g离心1min;4 加入60ul70%酒精，3000g4离心15min, 马上倒置96孔板，185g离心1min；5 70%酒精重复洗涤1次或2次；6 让残余的酒精在室温挥发干，加入10ul Hi-Di 甲酰胺，95变性4min，迅速置冰上4min,上样电泳。6、基因测序分析7、统计学处理采用Epidata软件编制录入数据库，应用PASW Statistics 18.0软件进行统计学分析。P53 突变点野生型p53 249 Arg 的编码子为agg, 突变变成Ser 后的编码子为agt )gactgtacca ccatccacta caacta