创新实验申请书.doc

项目编号大连理工大学大学生创新性实验计划项目申 报 书项目名称： 人源脐血造血干/祖细胞的体外扩增 项目负责人： 所在院系： 化工学院化学工程系 指导教师： 申请时间： 2009年6月29日 教务处制表项目名称人源脐血造血干/祖细胞的体外扩增申请经费10000元起止时间2009.9.1-2010 .8.31负责人姓名院（系）专业班级学号联系电话化工学院化工英强参加成员化工学院化工英强指导教师姓名职称讲师学位工学博士单位大连理工大学化工学院联系方式项目背景及研究意义（同类研究工作国内外研究现状与存在的问题等）数量稀少的造血干/祖细胞 (Hematopoietic stem/progenitor cells, HSPCS) 是体内各种成熟血细胞的唯一来源，它主要存在于脐带血、骨髓和外周血中。HSPCs在治疗贫血等血液疾病、白血病等癌症病人高剂量放化疗后的造血重建、基因治疗和免疫治疗以及制备成熟血液产品等方面有极重要的临床应用价值，因此多年来一直得到科研工作者和临床医生的高度重视和关注。脐带血是目前临床上HSPCs的重要来源，其富含更早期的HSPCs、免疫原性弱、对异源性抗原产生的抗体少、成熟性T细胞较少、采集和保存容易、无肿瘤细胞污染、对供者无损伤及副作用、CD34+ CD38- 与CD34+ CD33-的比例较高等一系列优点，使得与脐带血有关的造血干/祖细胞的研究成为热点。然而，脐带血中HSPCs的数量有限，无法满足临床移植的需要。近年来不断发展的造血细胞体外扩增技术，希望能通过在短时间内扩增细胞，来满足这一需求。但研究发现，添加大量细胞因子所扩增的HSPCs常发生过度分化，输入体内后的移植效果不能令人满意。因此，寻找更加合理的体外扩增手段，使造血细胞在体外大量扩增的同时，又能保持其干/祖细胞的特性，是研究中要解决的关键问题。自干细胞的增殖发育存在于微环境的假说被提出，大量研究证明了干细胞生态位区的存在。低氧浓度也是骨髓造血niche区域的特征之一，因此在HSPCs体外培养过程中，低氧环境也起到非常重要的作用。Smith和Koller等应用3%-7%的低氧环境进行造血细胞的体外培养，发现这些中度的低氧环境均能增加各系祖细胞的产率，且不影响它们的分化与成熟。并推测是因为其氧浓度接近于体内造血环境的氧含量，比在常氧条件下的培养体系能减少氧自由基的形成或增加细胞因子的生成。孙冰等进行了低氧和常氧条件下单核细胞和CD34+ 细胞的半固体和液体培养，计细胞总数和集落产率，发现体外低氧环境能显著增加CD34+ 造血干/祖细胞形成红系祖细胞的产率，且使其对细胞因子的依赖性降低，并对早期红系祖细胞的维持有增强作用。体内造血过程是一个非常复杂而周密的调节系统, 低氧所致造血细胞增殖、分化和凋亡的改变是由一系列细胞内信号转导、各种生物化学反应及相关基因表达改变的综合结果。有关微囊化基质细胞与造血干细胞共培养的研究，刘洋等在旋转壁式反应器中进行了微囊化骨髓间充质干细胞支持脐血造血干/祖细胞体外扩增研究。但是到目前尚没有在低氧环境中采用微囊化的方法包埋CD34+细胞进行体外扩增的报道。本研究正是基于目前对CD34+细胞和造血生态位区的最新认识，从工程学的角度设计出一种利用微囊化的CD34+细胞在低氧环境下培养的策略，实现造血干/祖细胞的有效体外扩增。研究内容和拟解决的关键问题研究内容：1） 人源脐血造血干/祖细胞（HSPCs）的体外分离和培养将从健康足月分娩产妇采集到的脐带血(含抗凝剂)缓慢叠加到Ficoll淋巴分离液上，两者体积比为1:12:1。然后，进行密度梯度离心(2500rmin-1，25 min)，吸取中间白膜层。将吸取到的细胞用含有10% 胎牛血清的D-Hanks平衡盐溶液离心洗涤两次(1000 rmin-1，5 min)，之后调整密度接种到培养瓶中备用。 2)脐带血CD34+细胞的分离和培养用免疫磁珠筛选分离法（magnetic activated cell sorting, MACS）分选CD34+细胞。然后将分离出的CD34+细胞接种到培养瓶中。在接种到6孔板共培养以前，CD34+细胞在T形瓶中培养过夜，以适应体外生长条件。3）脐带血CD34+细胞的微囊化培养a. 首先进行载CD34+细胞GAC微囊的制备。将已经分离的CD34+细胞进行传代培养以使其细胞数满足实验需求。然后取生长状态良好的CD34+细胞进行消化离心，加入明胶溶液(2.0% w/v，溶于DMEM培养基中)使细胞重悬，调整细胞密度为2106cellsmL-1。在培养箱中孵育30 min，使CD34+细胞与明胶充分接触。按海藻酸钠:明胶=3:1的比例加入海藻酸钠溶液(2.0% w/v)，混合均匀后，加入到注射器中，此时细胞密度为5105 cellsmL-1。开动微囊制备装置，在电压6 kV，流速40 mLh-1条件下，滴加1 mL细胞混合液到30 mL CaCl2(1.1 % w/v)溶液中进行凝胶化反应，形成载细胞明胶海藻酸钠微胶珠。然后将胶珠加到壳聚糖溶液(0.5% w/v)中覆膜反应10 min，形成载细胞GAC微胶囊。用PBS洗涤三次，再用无血清IMEM洗涤一次。b. CD34+细胞的微囊化培养。将制备好的微囊加到6孔板的一个孔中，并添加适量IMEM培养基。共制备6组微囊，分别在常氧(20%氧浓度)培养箱和低氧(5%氧浓度)培养箱中培养过夜，每种条件下设置3组进行平行实验。将微囊化CD34+细胞接种于6孔板中，每孔添加3 mL，平行3孔。低氧组记为a，常氧组记为a。培养基采用无血清IMEM，添加少量生长因子，包括2.4 ngmL-1 IL-3，10 ngmL-1 FL，20 ngmL-1 SCF，2.0 ngmL-1 GM-SCF，3.2 ngmL-1 TPO。一共培养7 d，每天取样前轻轻吹散细胞，使CD34+细胞分泌的信号因子和造血生长因子等分散均匀，每孔取0.2 mL细胞悬液进行各种检测，取样后补加相同体积的新鲜培养液。另外，分别在常氧和低氧条件下进行CD34+细胞单独培养作为对照，低氧组记为b，常氧组为b。培养和检测方法与微囊化培养组相同。 4）扩增后造血干/祖细胞的生物学鉴定 a. 细胞计数：使用血球细胞计数板和台盼兰拒染法进行总有核细胞计数。 b. CD34+细胞检测：使用CellQuest Pro流式细胞仪对新分离以及培养后的造血 细胞(细胞数大于1.0106个/组)进行表面抗原检测。首先，用含有1%胎牛血清的PBS溶液将细胞离心洗涤一次 (1000 rmin-1，5 min)。之后，加入CD34+抗体，并在4下避光孵育30 min。然后，再使用PBS离心洗涤一次细胞 (1000 rmin-1，5 min)，最后上机进行检测。 c. 集落形成检测：将扩增前的单个核细胞和扩增后的细胞分别以1105 cellsmL-1的密度接种于甲基纤维素半固体培养基 (MethoCultTM GF H4435. Stem Cell Technologies公司产品)中，内含30% FBS、10 gL-1 牛血清白蛋白、10-4 molL-1 2-巯基乙醇、2 mmolL-1 L-谷氨酰胺、SCF 50 ngmL-1、IL-3 20 ngmL-1、IL-6 20 ngmL-1、GM-CSF 20 ngmL-1、G-CSF 20 ngmL-1和EPO 3 UmL-1，于37、5% CO2、饱和湿度下培养7 d和14 d后计数CFU-Cs。 d数据统计分析：实验中统计数据以meanSD 表示，两组间比较采用t检验，四组间比较选用双因素方差分析，用Origin7.5 软件进行统计分析。 拟解决的关键问题1） 人源脐血造血干/祖细胞包囊的最佳接种密度；2） 细胞生长因子的最佳使用浓度。项目创新之处使用微囊化方法包埋造血干/祖细胞（CD34细胞）进行体外扩增项目进度安排（查阅资料、选题、自主设计项目研究方案、开题报告、实验研究、数据统计、处理与分析、研制开发、填写结题表、撰写研究论文和总结报告、参加结题答辩和成果推广等）2009年9月1日2010年2月29日：查阅资料、选题、自主设计项目研究方案、开题报告、实验研究；进行人源脐血造血干/祖细胞的体外分离和培养以及CD34+细胞的分离和培养;2010年3月1日2010年8月31日：进行CD34+细胞的微囊化培养，并完成扩增后造血干/祖细胞的生物学鉴定；填写结题表、撰写研究论文和总结报告、参加结题答辩。项目经费预算（如材料费、资料费、版面费、专利费、调研费等）材料费：4000元资料费：1500元版面费：1500元专利费：1500元调研费：1500元经费预算总计：10000元预期研究成果（如项目鉴定、学术论文、申请专利、获奖、推广应用等）预期发表SCI论文1-2篇。指导教师意见（从项目学科性、前沿性、可行性、研究性、可操作性和成效性加以评价）本项目针对当前国际造血干细胞领域的热点，在体