胶原样凝集素幻灯(免疫)

胶原样凝集素COLLECTIN,郑州大学医学院免疫学与微生物学教研室李付广,一、凝集素（LECTIN）的分类C-型凝集素:需要Ca2+维持活性的凝集素S-型凝集素:巯基依赖或-半乳糖结合的凝集素,二、胶原样凝集素历史上的重要发现,1906conglutinin;firstanimallectintobeassociatedwiththeimmunesystem1989-1991mannan-bindinglectin1999collectinliver1(CL-L1)2001collectinplacenta1(CL-P1)2003collectinkidney1(CL-K1),三、胶原样凝集素的一般特性,四、胶原样凝集素的结构,（一）一级结构特点1.N端富含半胱氨酸区段：7-28氨基酸，其中1-3半胱氨酸2.胶原样区：53-177氨基酸(-Gly-Xaa-Yaa-)n重复序列,Xaa、Yaa多为脯aa或羟脯aa3.颈区：24-28氨基酸，-helicecoiled-coils4.糖识别区（CRDs）：与相应的糖配体结合,(二)三级结构,1.同源三聚体的形成(亚单位)相同的三条肽链形成类似郁金香花朵2.亚单位进一步聚集成寡聚体单体-CL-43,CL-L1四聚体-SP-D,Conglutinin,CL-46(十字形结构)六聚体-SP-A,MBL(一束郁金香花),(三)糖结合特异性,胶原样凝集素的凝集素样活性存在于CRDs,由三个氨基酸基序决定:1.甘露糖结合基序:Glu-Pro-Asn2.半乳糖结合基序:Gln-Pro-Asp所有胶原凝样集素(SP-A除外)均具有甘露糖特异基序Glu-Pro-Asn,SP-A第三位的氨基酸由Arg(狗)或Ala替换Asn.,系统树,(五)结合微生物种类,五、胶原样凝集素在宿主防御方面的生物学功能,（一）凝集作用通过桥联，可使病原微生物凝集成大块，加强呼吸道黏膜纤毛清除作用，阻止病原吸附到细胞表面，抑制其定居和侵入，促进吞噬作用。,（二）补体激活作用1.MBL产生病原微生物感染早期刺激激活巨噬细胞和中性粒细胞TNF-,IL-1,IL-6急性期反应肝细胞MBL,CRP2.MBL途径(lectinpathway)MBL与病原微生物表面的mannose,fucose,GlcNAc结合启动的补体激活级联反应,(三)调理作用1.collectin的受体见下表2.collectin直接作为调理素3.激活补体成分C4b,C3b,iC3b4.吞噬作用的激活,(四)抑制微生物的生长SP-A,SP-D直接引起微生物细胞壁通透性增强,导致微生物生长抑制或死亡(五)调节炎症反应调节前炎症因子的合成分泌,(六)调节特异性免疫DCs抗原提呈,DCs成熟,T细胞增殖(七)调节过敏反应SP-A,SP-D抑制IgE与过敏原结合,抑制过敏早期组织胺释放,抑制晚期支气管炎症中淋巴细胞增殖,(八)对细胞凋亡的影响SP-A抑制型肺泡细胞凋亡,SP-A、SP-D,、MBL刺激凋亡细胞清除,HumanCL-L1的研究,1999年Ohtanik.等克隆和鉴定出一个编码新的胶原凝集素基因，称肝脏胶原凝集素1（collectinliver1，CL-L1），该基因定位于第八号染色体的长臂上，其基因结构由6个外显子（EX1EX6）和5个内含子（IN1IN5）组成，cDNA含有831bp插入片段，编码277个氨基酸残基。推测的氨基酸序列具有典型的胶原凝集素结构：N端富含半胱氨酸区、胶原样区、颈部和糖识别区。CL-L1与其他胶原凝集素相比，具有独特之处，MBL、SP-A和SP-D基因定位于第10号染色体，而CL-L1基因定位于第8号染色体，C末端具有4个重复的赖氨酸结构，CRD和颈区由一个外显子编码，胶原样区有5个外显子编码。胶原凝集素绝大多数为分泌型，存在于体液和分泌液中，只有CL-L1为可溶性胞浆内蛋白，因此推测CL-L1可能具有独特的功能。,Comparisonofthreeconstructs,Neck+CRDkkkk,M1234,25kDa,17kDa,Mmarker1beforeinductioninduction1hrinduction3hrsinduction5hrs,GrowthofstandardE.coliexpressionculture(200ml),(1)Inoculate20mlofSOB(containingampicillin100g/ml,chloramphenicol35g/ml)in100mlflask.Growtheculturesovernightat37C.(2)Inoculate200mlofprewarmedSOBmediawith10mloftheovernightculturesandgrowat37CwithvigorousshakinguntilanOD600of0.6isreached.(3)Takea1mlsampleimmediatelybeforeinduction.(4)InduceexpressionbyaddingIPTGtoafinalconcentration1mM.(5)Incubatetheculturesfor3hrs.Collectasecond1mlsample.(6)Harvestthecellsbycentrifugationat3500rpmfor25min.(7)Freezethecellsat-70.,PreparationofclearedE.colilysateunderdenaturingconditions,(1)Thawthecellpelletfor15minoniceandresuspendinlysisbufferat5mlpergramwetweight.(2)Stircellsfor15-60minatroomtemperature.(3)Centrifugelysateat10000gfor20-30minatroomtemperaturetopelletthecellulardebris.Savesupernatant,andfilterthesupernatantwith0.45mfilter.(4)Add10l2SDS-PAGEsamplebufferto10lsupernatantandstoreat-20CforSDS-PAGEanalysis.,PurificationofNeck+CRDKKKKofhCL-L1withNi-NTAcolumn,(1)Equilibratecolumnwith5columnvolumesoflysisbuffer.(2)Applylysatetocolumn.Collectthepass-throughforSDS-PAGEanalysis(recycleonce).(3)Washwith10columnvolumesofwashbufferuntilA280isbelow0.01.(4)Eluteproteinwithelutionbuffer.Collectthesingleproteinpeakcompletely.,Dialysisofrecombinantprotein,buffer1-8MureaTBS(pH7.6)/300ml;buffer2-TBS(pH7.6)/3000ml(1)Addelutionintomembranetube(MWCO15000),putthemembranein300mlbuffer1,stirringslowly.(2)Add100mlbuffer2at6hourintervals,total8times.(3)Atlastputmembranein2000mlbuffer2fordialysisoverni