免疫共沉淀(Immunoprecipitation--IP)解析.ppt

免疫共沉淀,(COimmunoprecipitation),用抗体将相应特定分子沉淀的同时，与该分子特异性结合的其他分子也会被带着一起沉淀出来的技术。这种技术常用于验证蛋白质之间相互特异性结合。免疫共沉淀可分为细胞内过表达蛋白、细胞内源性蛋白、组织内蛋白的免疫共沉淀。,基本原理,细胞裂解物中加入抗体，这样可与已知抗原形成特异的免疫复合物，若存在与已知抗原相互作用的蛋白质，则免疫复合物中还应包含这种蛋白质；经过洗脱，收集免疫复合物，然后分离该蛋白质，对该蛋白质进行N端氨基酸序列分析，推断出相应的核苷酸序列。将包含活性物质的组织或细胞构建成cDNA文库，以上述核苷酸序列为探针从cDNA文库中分离出cDNA克隆。,实验流程,（1）转染后24-48h可收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白免疫共沉淀酶抑制剂），冰上裂解30min,细胞裂解液于4C，最大转速离心30min后取上清；（2）取少量裂解液以备Westernblot分析，剩余裂解液加1g相应的抗体加入到细胞裂解液，4C缓慢摇晃孵育过夜；（3）取10lproteinA琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗3次，每次3,000rpm离心3min；（4）将预处理过的10lproteinA琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4C缓慢摇晃孵育2-4h，使抗体与proteinA琼脂糖珠偶连；（5）免疫沉淀反应后，在4C以3,000rpm速度离心3min，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗34次；最后加入15l的2SDS上样缓冲液，沸水煮5分钟；（6）SDS-PAGE,Westernblotting或质谱仪分析。,一、样品处理：二、抗体-agarosebeads孵育三、抗体-agarosebeads复合物洗涤：四、鉴定,免疫共沉淀技术的应用,肿瘤,酶与病毒信号传导寄生虫,免疫共沉淀技术的优点与局限性,优点：与蛋白质亲和层析一样，检测的产物是蛋白质的粗提物；抗原与相互作用的蛋白以细胞中相类似的浓度存在，避免了过量表达所造成的人为效应；蛋白质以翻译后被修饰的天然状态存在；复合物以天然状态存在，蛋白的相互作用可以在天然状态下进行，可以避免人为影响，可以分离得到天然状态下相互作用的蛋白复合体.,局限性:需要多克隆抗体或mAb，因而对大规模筛选未知蛋白会遇到障碍。免疫共沉淀同样不能保证沉淀的蛋白复合物为直接相互作用的两种蛋白。用于免疫共沉淀的抗体不总是与操作相合适，与Westernblotting或者ELISA相比容易出现假阳性反应。灵敏度不如亲和色谱高。不适于检测构成巨大、不溶性的大分子结构的蛋白质一蛋白质相互作用。,乙醇沉淀dna和异丙醇沉淀dna的区别,异丙醇和酒精都是有机溶剂，一般来讲，提取质粒的时候一开始都要用异丙醇沉淀，因为异丙醇沉淀的效果要好一些，但最后大多用酒精沉淀，因为酒精容易挥发，对下游的实验影响小。异丙醇比较疏水，能很更好地沉淀核酸，用乙醇的目的是去盐，它比异丙醇更亲水，所以能去掉一些盐离子。有时还用70%的乙醇洗样品也是为了增加盐的溶解度。在沉淀核酸时可用乙醇与异丙醇，乙醇的极性要强于异丙醇，所以一般用2倍体积乙醇沉淀，但在多糖、蛋白含量高时，用异丙醇沉淀可部分克服这种污染，尤其用异丙醇在室温下沉淀对摆脱多糖、杂蛋白污染更为有效。异丙醇沉淀核酸时，高浓度盐存在将使大量多糖存在在溶液中，从而可达到去多糖的作用。但高浓度的盐存在会影响核酸的进一步操作，因此必须用乙醇多次洗涤脱盐。,异丙醇：优点：所需容积小且速度快，适用于浓度低，而体积大DNA样品的沉淀。0.541.0倍体积的异丙醇可选择性沉淀DNA和大分子rRNA和mRNA；但对5sRNA、tRNA和多糖产物不产生沉淀，一般不需要在低温条件下长时间放置。缺点：易使盐类（如NaCl、蔗糖）与DNA共沉淀；在DNA沉淀中异丙醇难以挥发除去，所以常规需要用70的乙醇漂洗DNA沉淀数次。乙醇：沉淀DNA乙醇是首选的有机溶剂