第二章 ,光谱分析仪器与技术

第二章光谱分析仪器与技术,钱士匀,目录,第一节吸收光谱分析仪器与技术第二节发射光谱分析仪器与技术第三节散射光谱分析仪器与技术,重点提示,1.光的基本性质和朗伯-比尔定律的意义是什么？2.光谱分析技术如何分类，各有哪些技术特征？3.紫外-可见分光光度计按其光学系统可分为哪几类，各有何特点？4.原子吸收分光光度计的结构组成及影响测定灵敏度和精确度的因素有哪些？5.简述原子发射光谱分析的特点及其局限性。6.荧光光谱仪的种类和基本结构有哪些？影响荧光强度的因素有哪些？7.散射光谱技术分析方法有哪两类？简述其检测原理。8.根据雷莱光散射理论，散射光强度主要与哪些因素有关？,光谱分析技术,光谱分析技术是利用物质具有发射光谱、吸收光谱或散射光谱的特征，对物质进行定性、定量分析的一类分析方法。光谱分析依据光谱特征可分为吸收光谱分析技术、发射光谱分析技术和散射光谱分析技术三大类。光谱分析技术在生物化学检验中是最基本和最常用的，它因具有灵敏、准确、快速、简便、选择性好等特点而被广泛使用。,第一节吸收光谱分析仪器与技术,一、紫外-可见分光光度分析仪器与技术,（一）光的基本性质光是一种电磁波，具有波动性和粒子性。光的波长可用纳米（nm）为单位来表示。E=h（二）光的选择吸收与物质颜色的关系物质的分子或离子团对可见和紫外光区的光波具有选择吸收作用。可见光谱分析要求被测溶液的颜色与所用的单色光互补，以求达到溶液对光的最大吸收。,吸收光谱（absorptionspectrum）：不同的物质会吸收不同波长的光。改变入射光的波长，并依次记录物质对不同波长光的吸收程度，就得到该物质的吸收光谱。,第一节紫外-可见分光光度计的工作原理和基本结构,各种试液的紫外扫描图谱A一葛根素；B空白微乳；c一空白肠循环液；D一酚红,吸收光谱：又名吸收曲线。不同波长光对样品作用不同，吸收强度不同以A（波长做横坐标，吸光度做纵坐标）作图,一、紫外-可见分光光度分析仪器与技术,（三）紫外-可见分光光度技术紫外光（200400nm），可见光（400780nm）1.朗伯-比尔定律一束单色光通过物质溶液时，溶液的吸光度与溶液的浓度及液层厚度的乘积成正比。A=KCbA为吸光度；K为比例系数；C为吸光物质的浓度；b为溶液的液层厚度。当K、C一定时，吸光度A与液层厚度b成正比，称为朗伯定律（Lambert定律）；当K、b一定时，吸光度A与溶液浓度C成正比，称为比尔定律（Beer定律）。,一、紫外-可见分光光度分析仪器与技术,1.朗伯-比尔定律（1）吸光度：吸光度表示单色光通过溶液时被吸收的程度，以A表示。（2）透光度：透光度又称为透光率，表示透过光占入射光的比例，以T表示。吸光度与透光度之间的关系：A=log=logT（3）比例系数K：K值表示单位浓度、单位液层厚度溶液的吸光度，是与吸光物质性质及入射光波长有关的常数。K值的表示方法依赖于溶液浓度的表示方法。吸收系数a、摩尔吸收系数、百分吸收系数。,一、紫外-可见分光光度计的工作原理,朗伯-比尔定律：,I0：入射光强度b:液层厚度T:透光度k:吸光系数,C:溶液浓度I:透射光强度A:吸光度,一、紫外-可见分光光度分析仪器与技术,2.定量分析的方法（1）直接比较法：分别测出试样溶液及标准溶液的吸光度Ax及As，进行比较可求得样品的浓度。Cx=AxCsAs（2）标准曲线法：,一、紫外-可见分光光度分析仪器与技术,2.定量分析的方法（3）摩尔吸光系数（=K）检测法：在给定条件（单色光波长、溶剂、温度等）下，吸光系数是表示物质特性的常数。根据朗伯-比尔定律，可以用C=A/b公式直接计算物质的含量。（4）双波长分光光度法（补充）：,当吸收光谱相互重叠的两种组分共存时，利用双波长分光光度法可对单个组分进行测定或同时对两个组分进行分析。,1、朗伯-比尔定律：A=KCb2、吸光度与透光度：A=log=logTA：吸光度；I。：入射光的强度；I1：透射光的强度；T：透射比，或称透光度；K：系数，可以是吸收系数或摩尔吸收系数b：吸收介质的厚度，一般以cm为单位；C：吸光物质的浓度，单位可以是g/L或mol/L。3、直接比较法（有标准溶液时）：Cx=AxCsAs4、摩尔吸光系数（）检测法（在给定条件（单色光波长、溶剂、温度等）下）：C=A/b5、吸光系数K:(Akbc)(1)k与入射波长、溶液的性质以及温度有关。吸收物质在特定波长和溶剂条件下的特征常数；不随浓度c和光程长度b的改变而改变。在温度和波长等条件一定时，k仅与吸收物质本身的性质有关；,（2）是物质吸光能力的量度，可作为定性鉴定的参数；同一物质在不同波长下的k值是不同的。在最大吸收波长max处的摩尔吸光系数，常以kmax表示。Kmax表明了该吸收物质最大限度的吸光能力，也反映了光度法测定该物质可能达到的最大灵敏度。kmax越大表明该物质的吸光能力越强，用光度法测定该物质的灵敏度越高。（3）k在数值上等于单位浓度为、单位液层厚度为时特定溶液在某一波长下的吸光度。浓度单位不同：吸收系数a、摩尔吸收系数、百分吸收系数,一、紫外-可见分光光度分析仪器与技术,（四）紫外-可见分光光度计的基本结构,1.光源可见光区：钨灯、卤钨灯光源，波长范围在3202500nm。紫外区：氢、氘灯光源，波长185400nm。,一、紫外-可见分光光度分析仪器与技术,（四）紫外-可见分光光度计的基本结构2.单色器将来自光源的复合光分解为单色光并分离出所需波段光束的光学装置，由棱镜或光栅、狭缝和准直镜等部分组成。常用单色器：棱镜、干涉滤光片、光栅分光。3.吸收池分光光度计中用来盛放溶液的容器，又称比色皿或比色杯。多用石英比色杯，适用于紫外和可见光区；玻璃比色杯只能用于可见光区。自动生化分析仪多用塑料比色杯。,一、紫外-可见分光光度分析仪器与技术,（五）紫外-可见分光光度计的类型单光束分光光度计（1）单光束可见光分光光度计,1.光源；2.聚光透镜；3.色散棱镜；4.准直镜；5.保护玻璃；6.狭缝；7.反射镜；8.光栅；9.聚光透镜；10.吸收池；11.光门；12.保护玻璃；13.光电倍增管,一、紫外-可见分光光度分析仪器与技术,（五）紫外-可见分光光度计的类型单光束分光光度计单光束紫外-可见分光光度计,一、紫外-可见分光光度分析仪器与技术,（五）紫外-可见分光光度计的类型2.双光束分光光度计,一、紫外-可见分光光度分析仪器与技术,（五）紫外-可见分光光度计的类型3.双波长分光光度计,一、紫外-可见分光光度分析仪器与技术,（六）分光光度计分析条件的选择入射光波长的选择选择最强吸收带的最大吸收波长（max）的单色光为入射光，以得到最大的测量灵敏度。当最强吸收峰的峰形比较尖锐时，往往选用吸收稍低，峰形稍平坦的次强峰或肩峰进行测定。2吸光度范围的选择选择适宜的吸光度范围，以保证测量结果的误差最小。吸光度范围为0.12.0时，测定结果的相对误差最小。,一、紫外-可见分光光度分析仪器与技术,（六）分光光度计分析条件的选择3.狭缝宽度的选择狭缝宽度影响测定的灵敏度和校准曲线的线性范围。狭缝宽度增大，入射光的单色性降低，会使灵敏度下降，校准曲线偏离朗伯-比尔定律。狭缝宽度大约是试样吸收峰半宽度的1/10。4.显色反应条件的选择反应的生成物的摩尔吸光系数较大；反应应有较高的选择性；反应生成物有足够的稳定性；反应生成物的组成恒定。,二、原子吸收分光光度分析仪器与技术,（一）原子吸收分光光度法原理E=E2El=h式中：E为能级差；E2、E1分别为高、低能级的能量；h为普朗克常数；为吸收光的频率。电子从低能级跃迁到高能级时，需要吸收特定波长的光。用特定波长的光去照射待测元素，待测元素就会吸收一部分光能而被激发，使得入射光变弱、变暗，如同溶液对单色光的吸收。利用光电检测器检测出入射光线的强度变化即待测元素的吸光度，根据朗伯-比尔定律，得到待测元素的浓度。,二、原子吸收分光光度分析仪器与技术,（二）原子吸收分光光度计的基本结构,1600条谱线,二、原子吸收分光光度分析仪器与技术,（二）原子吸收分光光度计的基本结构1光源能够产生待测元素所需的特征线性光谱，谱线的宽度要窄，发射强度要高，还要十分稳定。常用的光源为空心阴极灯。2原子化器提供合适的能量，将样品干燥、蒸发并转化为所需的基态原子蒸气。原子化器有火焰原子化器与石墨炉原子化器。,二、原子吸收分光光度分析仪器与技术,（二）原子吸收分光光度计的基本结构3分光系统（单色器）单色器由入射和出射狭缝、反射镜和色散元件等组成，作用是将所需的共振吸收线与邻近干扰线分离。4检测系统由检测器、放大器、对数变换器和显示装置组成。检测器的作用是进行光电信号转换变成电信号，然后再经放大，滤波后，被测信号进行对数变换，变成线性信号，最后由读出装置显示读数或由记录仪记录下来。,二、原子吸收分光光度分析仪器与技术,（三）原子分光光度计分析条件的选择1吸收波长选择元素的共振线作为分析线；分析浓度较高的样品时，可选择灵敏度较低的谱线进行分析；有些元素的共振线靠近远紫外区，最好用背景吸收校正法扣除背景吸收，若浓度较高，可改用次灵敏线作为分析线。2灯电流在所选的电流下，光源能够提供足够强和稳定的入射谱线，以提高信噪比和测定精确度；同时，还要有较高的测定灵敏度。,二、原子吸收分光光度分析仪器与技术,（三）原子分光光度计分析条件的选择3狭缝的宽度狭缝宽度的选择应以能分开分析线与邻近线为原则。4燃烧器的高度必须使测量光束从自由原子浓度最大的火焰区域通过。5雾化器的调节一般约4ml/min的进样量是比较合适的。,第二节发射光谱分析仪器与技术,一、原子发射光谱分析仪器与技术,（一）原子发射光谱分析基本工作原理当原子受到外界能量的作用时，原子由于与高速运动的气态粒子和电子相互碰撞而获得了能量，使原子中外层电子从基态跃迁到激发态，使样品蒸发并将各组分转变成气态原子或离子，引起气体中各基本粒子的电激发。被激发的原子或离子回到基态时发射出每个元素的特征谱线。研究特征谱线的波长和强度就可以对被测样品进行定性和定量分析。原子发射光谱分析对一个试样既能同时进行多元素分析，又可测定元素各种不同的含量（高、中、微含量）。具有分析速度快，选择性、准确性高，检出限低，样品消耗少等优点。,一、原子发射光谱分析仪器与技术,（二）原子发射光谱分析仪器仪器基本结构原子发射光谱仪由激发光源和光谱仪两部分组成。（1）激发光源：提供使试样中被测元素原子化和原子激发发光所需要的能量，使样品蒸发、原子化、激发，产生光谱。常用火花式与电感耦合等离子体两种方式。（2）光谱仪：常用的光谱仪有棱镜摄谱仪、光栅摄谱仪和光电直读光谱仪。光谱仪的作用是将光源发射的电磁辐射色散后，得到按波长顺序排列的光谱，并对不同波长的辐射进行检测与记录。,一、原子发射光谱分析仪器与技术,2.原子发射光谱分析方法（1）定性分析方法元素的特征谱线波长是由元素的原子性质所决定的。通过检查谱图上有无特征谱线的出现来确定该元素是否存在。（2）定量分析方法：根据样品中被测元素的谱线强度来确定其元素含量的方法。元素的谱线强度与该元素在试样中浓度c的相互关系：I=acb式中：I为被测元素谱线强度；a是与样品的蒸发、激发过程和样品组成等有关的一个参数；c为被测元素的浓度；b为自吸系数，其数值与谱线的自吸有关。,一、原子发射光谱分析仪器与技术,（三）原子发射光谱分析的干扰与处理基体效应是其他元素的存在影响被测元素谱线强度的干扰作用。样品组成越复杂，基体效应越明显，分析误差越大。向样品和标准样品中加入经过选择的辅助物质，如光谱缓冲剂或光谱载体，以消除或减少基体干扰。光谱缓冲剂可稀释样品，能控制样品在弧焰中蒸发、激发的温度和降低背景影响。光谱缓冲剂纯度要高，谱线简单。按所起的作用不同。光谱载体的作用是改变样品中被测元素的熔点、沸点，从而改变各元素的蒸发状况，起到增强被测元素谱线强度或抑制干扰元素谱线强度等作用，提高分析的灵敏度。,二、荧光分析仪器与技术,（一）荧光分析工作原理物质经高能量射线激发后，所发出的比原激发光波长较长的可见光称为荧光。某些物质受到紫外光照射后，发射出比吸收的紫外光波长更长或相等的紫外光荧光或可见光荧光。通过测定物质分子产生的荧光强度进行分析的方法称为荧光分析。荧光分析可应用于物质的定性检测及定量分析。荧光法的主要特点是灵敏度高，检出限为10-710-9g/ml。荧光法的选择性强。荧光法样品用量少、操作简便。,二、荧光分析仪器与技术,（二）荧光光谱仪的基本结构激发单色器中的激发光，投射到样品上。样品杯里的荧光物质被激发而发出荧光光谱。荧光光谱投射到光电检测器上。光电检测器将荧光强度转换成电信号，信号强度与物质浓度的成正比。激发光源激发荧光物质产生荧光，通常用氙灯、汞灯、氙-汞弧灯、激光器及闪光灯等。2.单色器分为激发单色器和发射单色器，分别将入射的激发光和发射的荧光变成单色光。,二、荧光分析仪器与技术,（二）荧光光谱仪的基本结构,二、荧光分析仪器与技术,（三）分子荧光定量分析方法分子荧光定量分析方法与紫外-可见分光光度法相同，也是采用直接比较法和标准曲线法。直接比较法Cx=Cs式中：Cx为待测样品溶液的浓度；Cs为标准溶液的浓度；Fx为待测样品溶液的荧光强度；Fs为标准溶液的荧光强度。2.标准曲线法用标准物质配成一系列不同浓度的标准溶液，测定标准系列溶液的荧光强度。以荧光强度为纵坐标、标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，然后测定待测样品的荧光强度，由样品的荧光强度和标准曲线求出待测样品中荧光物质的含量。,二、荧光分析仪器与技术,（四）影响荧光强度的因素溶剂的影响荧光强度在一定范围内可随溶剂黏度的减小而减小。溶剂和荧光物质反应，会使荧光峰的波长和荧光强度改变。溶剂中的杂质会影响荧光光谱。2.温度的影响荧光强度对温度变化敏感。温度增加，荧光效率和荧光强度会明显降低。3.pH的影响pH影响荧光物质的存在形式。苯胺在pH712的溶液中以分子形式存在发射蓝色荧光。在pH2和pH13的溶液中呈苯胺离子形式不能发射荧光。,二、荧光分析仪器与技术,（四）影响荧光强度的因素。4.荧光淬灭荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子的相互作用引起荧光强度降低，或荧光强度不与浓度成线性关系的现象。荧光熄灭剂，如卤素离子、重金属离子、氧分子以及硝基化合物、重氮化合物等均为常见的荧光熄灭剂。5.其他干扰因素光散射可以影响荧光强度；洗涤器皿的合成去污剂常能产生很强的荧光；玻璃器皿所使用的润滑油也能产生较强荧光。,第三节散射光谱分析仪器与技术,一、散射光谱技术基本原理,光的散射光在媒质中传播的过程中，不完全沿着原来的方向传播，沿着四面八方或多或少都有光线存在的现象。散射光谱分析测定光线通过溶液后的光吸收或光散射程度的一类免疫浊度定量分析方法。测定方式分为散射免疫比浊法和透射免疫比浊法。按照形成复合物的速度测定可分为终点浊度法和速率浊度法。,一、散射光谱技术基本原理,透射法,散射法,雷莱散射（瑞利）,米-德拜散射,一、散射光谱技术基本原理,（一）浊度分析的基本原理1胶体溶液指一定大小的固体颗粒或高分子化合物分散在溶媒中所形成的溶液，其质点一般在1100nm之间。2朗伯-比尔光透射理论E=KC式中：E为吸光度变化率；K为常数；C为溶液的浓度。,一、散射光谱技术基本原理,（一）浊度分析的基本原理3雷莱（Rayleigh）光散射理论粒子尺度远小于入射光波长时（小于波长的十分之一）。式中：I0为入射光强度；为入射光波长；n1、n2为分散介质和分散相的折射率；为单位体积内的粒子数；V为单个粒子的体积。,一、散射光谱技术基本原理,（一）浊度分析的基本原理3雷莱（Rayleigh）光散射理论（1）单位体积的散射光强度与每个粒子体积的平方成正比。（2）散射光总能量与入射光波长的四次方成反比。入射光波长愈短，散射愈显著（蓝光）。（3）分散相与分散介质的折射率相差愈显著，则散射作用亦愈显著。（4）散射光强度与单位体积中的粒子数成正比。公式仅适用于稀释溶液，微粒直径约为入射光波长的1/201/10的溶液。,一、散射光谱技术基本原理,（一）浊度分析的基本原理4.米-德拜（Mie-Debye）散射理论当粒子直径与入射光波长的比例大于1/10值时，各方向散射光的强度成为不对称或各向异性的了，此时正向散射光强度趋于增强。式中为光信号检测器与入射光之间的夹角。表明检测器的位置与被测光信号的性质及强度之间的关系。米-德拜公式适合于粒子直径略小于入射光波长的情况，和粒径等于或大于入射光波长的场合。这些修正反映了散射光的不对称性与粒子大小及入射光波长之间的相关性变化。,一、散射光谱技术基本原理,（二）浊度分析的基本方法,透射免疫比浊法检测器的与光源呈直线测定透射光强度和被测溶液中微粒浓度关系。散射免疫比浊法检测器在596角的方向上测量散射光强度和被测溶液中微粒浓度关系。,一、散射光谱技术基本原理,（二）浊度分析的基本方法1.透射免疫比浊法测定入射光因反射、散射或吸收后的衰减，读数以吸光度（A）表示，这种A值反映了透射光和入射光的比率。免疫复合物大小为35100nm之间，选择290410nm波长最佳。加入促聚剂，如4%聚乙二醇（MW60008000Da）可使复合物的形成在310分钟内完成。透射免疫比浊法可分为沉淀反应透射免疫浊度测定和免疫胶乳浊度测定。抗原抗体形成抗原-抗体复合物，使反应液出现浊度，与一系列的标准品对照，即可计算出未知蛋白质的含量。,透射免疫比浊法,灵敏度较低。要求抗原抗体复合物分子应足够大、足够多，分子太小则入射光直接通过。加增敏剂。直线光路，灵敏度有先天缺陷。设计散射比浊。透射比浊是依据透射光减弱的原理来定量的，因此只能测定抗原抗体反应的第二阶段，检测仍需抗原抗体温育反应时间，检测时间较长。,缺陷,一、散射光谱技术基本原理,（二）浊度分析的基本方法2散射免疫比浊法光源从水平轴照射，通过溶液时，遇到抗原-抗体复合物粒子，光线被粒子颗粒折射，发生偏转形成光散射。偏转角度可以从096，偏转的角度可因光线波长和粒子大小不同而有所区别。散射光的强度与抗原-抗体复合物的含量、散射夹角成正比，波长成反比。,二、常用浊度法分析仪器,（一）透射浊度分析仪1分光光度仪普通分光光度仪可用于透射比浊分析，待测溶液在近紫外光区（400500nm）有一吸收峰，终点法可获得定量数据（A值）。2自动生化分析仪临床实验室的自动生化分析仪一般均可用于浊度测定。（二）散射浊度分析仪速率法散射浊度分析仪终点法散射浊度分析仪,散射免疫比浊法,速率散射比浊分析,基本原理：抗原抗体结合反应的一种动态测定法，适时检测抗原抗体复合物形成的散射光信号。是测定抗原抗体结合反应的动态过程。所谓速率，是在单位时间内抗原抗体结合形成复合物的速度。将各单位时间内形成复合物的速率及测定的散射信号连接在一起，即是动态的速率比浊分析。当仪器测定到某一时间内形成速率下降时，即出现速率峰，该峰值的高低，即代表所测抗原的量。速率峰值一般在25秒时出现。在反应介质中加入一定量的促凝剂，可加速抗原抗体复合物的形成，以减少反应时间。速率法的优点：是快速、不需要减去样本和试剂本底读数，校正结果也较稳定。,免疫比浊技术分类,按光路,透射免疫比浊散射免疫比浊,按测定时间,终点比浊速率比浊,按增敏剂,无增敏PEG增敏胶乳增敏,本章小结,根据光谱来鉴别物质和确定它的化学组成的方法叫做光谱分析技术。依据光谱特征可分为吸收光谱分析技术、发射光谱分析技术和散射光谱分析技术三大类。原子光谱法有：原子发射光谱法、原子吸收光谱法及原子荧光光谱法等。分子光谱法有：紫外-可见分光光度法、红外光谱法、分子荧光光谱法和分子磷光光谱法等。紫外-可见分光光度计是医学实验室的重要仪器，郎伯-比尔定律是比色分析的基本定律。,本章小结,原子光谱分析仪器包括原子吸收和原子发射光谱分析仪，仪器基本结构包括光源、原子化器、分光系统及检测系统。荧光光谱分析仪器是利用物质吸收能量后可发射荧光，通过测定物质分子产生的荧光强度进行物质定性与定量的仪器。散射光谱分析技术主要有透射免疫比浊分析和散射免疫比浊分析两种，其中速率测定和胶乳粒子增敏是散射比浊分析的发展方向。,原子吸收与普通分光光度法的差别,普通分光光度法,原子吸收光谱,分子或离子团的吸收,基态原子的吸收,溶液,基态原子蒸气,宽带吸收(几几十nm),窄带吸收(0.00Xnm),连续光源,锐线光源,低分辨率单色器,高分辨率单色器,吸收池,原子化器,1.在分光光度计中，常因波长不同而选用不同的检测器，下面两种检测器各适用于哪个光区？A.光电倍增管用于（可见紫外）B.热电偶用于（红外）（首都师范大学1999年）2.原子吸收分析法与发射光谱分析法，其共同点都是利用_原子外层电子发生能级跃迁产生的光谱现象_，在本质上有区别，前者利用的是_现象，后者利用的是_现象。（首都师范大学2001年）,考研真题,3.原子吸收法测量时，要求发射线与吸收线的一致，且发射线与吸收线相比，谱线半宽要得多。产生这种发射线的光源，通常是4.荧光分光光度计通常具有两个单色器，其中，一个称，其作用是；另一个称，其作用是。5.双光束原子吸收分光光度计由于两光束是由光源