mTOR抑制剂的筛选方法

mTOR抑制剂的筛选方法【摘要】雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是是丝氨酸/苏氨酸激酶分子靶位。mTOR是细胞生长增生的中心调控者，直接或间接参与细胞生长增生有关环节的调控。人体多种肿瘤细胞中可见mTOR通路的失调。近年来，有关mTOR抑制剂的专利申请不断增加，设计、合成、筛选结构新颖的mTOR抑制剂已经成为抗肿瘤药物研发的重大课题。本文就mTOR的结构功能、信号转导通路及mTOR抑制剂的筛选方法进行简单的介绍。【关键词】雷帕霉素靶蛋白 雷帕霉素靶蛋白抑制剂 药物筛选TOR(target of rapamycin，雷帕霉素靶蛋白)是一类进化上非常保守的蛋白激酶家族，广泛存在于各种生物细胞中。1994年，Brown等证实并克隆了哺乳动物TOR基因，其产物只有一种蛋白，即mTOR(mammalian target of rapamycin，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白)。mTOR属P13K蛋白激酶类家族，是P13KPKB信号通路下游的一个效应蛋白，其底物主要控制与细胞生长和增殖密切相关的蛋白质的合成。mTOR控制细胞内mRNA的翻译，参与膜蛋白转运，蛋白质降解，蛋白激酶C信号转导和核糖体合成等一系列生理病理过程。1. mTOR的分子结构mTOR分子结构复杂，由2 549个氨基酸残基组成，分子中有数个各自独立而保守的结构域，类似于酵母中TOR的结构。mToR分子的氨基端存在20个串联重复序列，每一个重复序列包含2个分别由40个氨基酸残基组成的螺旋，每个螺旋都有一个亲水基团和一个疏水基团。这种重复结构介导蛋白质之间的相互作用，并有利于mTOR定位于浆膜。mTOR分子羧基端的中部是蛋白激酶域，结构和P13K激酶的催化域相似。蛋白激酶域的上游是FRB域，为FKBPl2一雷帕霉素复合物与mTOR相互作用的区域，该区发生突变后可以完全阻止雷帕霉素对mTOR的抑制作用。FRB 下游大约500个氨基酸残基处为FAT域，作用可能是与mTOR分子末端的FATC域形成一个空间结构，从而暴露mTOR分子的催化域。FATC域和NRD域位于mTOR分子羧基末端，其中NRD域在FATC和激酶催化域之间，是mTOR的负性调节域，而FATC域对mTOR的活性有着至关重要的作用，FATC结构中任何一个氨基酸残基的缺失都能使mTOR丧失催化能力。由于mTOR包含的几个相对独立的结构域都能够和其他蛋白质发生作用，因而其能结合不同的蛋白质。实际mTOR存在两种复合物形式，这两种复合物的结构在细胞中都是相对保守的。mTOR形成的两种不同复合物mTORC1和mTORC2。已知的mTOR对肿瘤细胞生长、分化和代谢的作用均由mTORC1完成，mTORC2对雷帕霉素不敏感。FRB区，这个区域为免疫抑制剂FK506结合蛋白与雷帕霉素的结合位点，是雷帕霉素与mTOR相互作用的区域。所以这个区域突变后可完全阻止雷帕霉素对mTOR的抑制作用，FRB区之后为激酶区，作用是使丝氨酸苏氨酸发生磷酸化。最后的FATC为FAT碳末端区。FAT和FATC区可调节mTOR激酶的活性。2. mTOR的信号转导通路mTOR可通过P13KAKT途径或AMPK途径来发挥作用。目前研究较多的是P13KAKT途径。该途径在肿瘤中常被过度激活，使细胞周期调节失控，引起细胞转化和肿瘤进展。正常情况下，生长因子诱导mTOR的活化是通过激活P13K实现的。P13K可磷酸化肌糖环3-羟基的磷酸肌醇。细胞膜3-磷酸磷脂(P13Ps)与Akt的PH区域连接，导致Akt转位至浆膜，从而与磷酸肌醇依赖性激酶1(PDKl)接触。PDKl负责Akt的磷酸化，从而激活Akt。激活的Akt可磷酸化结节性硬化复合体2(TSC2)并减弱后者对mTOR的抑制作用。Akt和P13K在功能上属于原癌基因，受到抑癌基因PTEN的负性调节。PTEN可使肌糖环3-羟基的磷酸肌醇磷酸化，在胚胎发育、细胞迁移、凋亡和有效终止P13K介导的信号转导方面起着关键性的作用。PTEN突变在人类实体肿瘤非常常见。活化的P13K位于细胞膜，可催化磷脂酰肌醇P2转变为磷脂酰肌醇P3，后者募集并激活AKT。PTEN可以下调PtdlinsP3的浓度。从而抑制P13KAKT途径。AKT对mTOR的激活主要通过以下两种方式：一种是磷酸化mTOR而直接激活它；另一种是磷酸化并抑制TSC1TSC2二聚体。TSClTSC2是mTOR最重要的上游信号分子。Rheb是mTOR激活蛋白，TSClTSC2二聚体通过抑制Rheb阻止mTOR的活化。 由于P13KAktmTOR通路分子发生突变或者上游信号通路分子激活，肿瘤细胞内P13AktmTOR通路可被激活，从而使细胞增殖失控、凋亡抗拒以及引起细胞的代谢改变。mTOR经过上述两种途径被活化后可将信号传递给下游通路，通过两种途径调节下游核糖体和mRNA结合，一是使抑制mRNA翻译的4EBP1磷酸化失活，二是使促进mRNA翻译的S6K1磷酸化而激活，从而启动核糖体蛋白的翻译。两条途径的最终效应都是促进mRNA翻译，从而直接或间接调控翻译起始阶段、微丝形成、膜转运、蛋白降解、蛋白激酶C(PKC)通路、核蛋白体合成、tRNA合成及转录等。3. mTOR抑制剂mTOR抑制剂雷帕霉素及其衍生物能结合FKBP(FKS06结合蛋白)，抑制mTOR，阻止P70S6K和4EBP磷酸化。同时也间接抑制了其它相关蛋白转录和翻译，具有抗菌、免疫抑制和抗肿瘤作用。mTOR抑制剂是具有抗排斥、抗增殖、抗肿瘤及延长哺乳动物寿命等作用的多功能药物。第一个mTOR抑制剂雷帕霉素（Rapamycin，现称西罗莫司，Sirolimus）及其后来通过化学半合成获得的西罗莫司衍生物已作为免疫抑制剂用于器官移植的抗排斥反应、作为雷帕霉素涂层支架治疗冠状动脉支架植入后的再狭窄、作为治疗肾癌等癌症的mTOR靶向抗癌药物。目前又发现雷帕霉素能够治疗老年性痴呆症，也是第一个被报道能够延长哺乳动物生命的药物。雷帕霉素及其衍生物临床上的新适应症逐步被开发，它们在治疗罕见病、疑难病症方面可能发挥更大的作用。近年来，有关mTOR抑制剂的专利申请不断增加，设计、合成、筛选结构新颖的mTOR抑制剂已经成为抗肿瘤药物研发的重大课题。4. mTOR抑制剂的筛选方法（1）酶联免疫吸附法（ELISA）ELISA的原理是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。mTOR的Ser2448磷酸化是上游信号AKT激酶和下游p70S6激酶反馈作用的结果，通过检测mTOR的Ser2448磷酸化程度可以检测mTOR的活性。 我们找了Abcam公司 的mTOR pSer2448 in vitro ELISA试剂盒，这个试剂盒是专为在细胞和组织裂解液精确测量mTOR的活性。具体如下：采用mTOR特定的抗体包被微孔板，制成固相载体，样品吸入孔中，样品中存在的mTOR被固定化的抗体结合到孔中。洗涤后，在微孔中加入检测抗体。洗去未结合的检测抗体，将酶标抗体加入孔中。各孔再次洗涤，将TMB底物溶液加入到孔中，TMB被催化转化成蓝色，蓝色的深浅与磷酸化的Ser2448的数量呈正相关。加入盐酸停止反应，颜色从蓝色变到黄色，用酶标仪在450nm波长下测定光密度值（OD值），可计算样品浓度。受检抗原： mTOR phospho Ser2448 检测抗体： anti-mTOR phospho Ser2448 detector antibody酶标: HRP-conjugated label specific for the detector antibody底物： TMB检测：最后加入盐酸停止反应，用酶标仪在450nm处测定OD值。 分析：OD值越小，mTOR的Ser2448磷酸化程度越低，抑制剂作用越强。（2）荧光共振能量转移（FRET）荧光共振能量转移是指两个荧光发色基团在足够靠近（710nm）时，当供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态，在该电子回到基态前，通过偶极子相互作用，实现了能量向邻近的受体分子转移（即发生能量共振转移）。FRET是一种非辐射能量跃迁，通过分子间的电偶极相互作用，将供体激发态能量转移到受体激发态的过程，使供体荧光强度降低，而受体可以发射更强于本身的特征荧光（敏化荧光），也可以不发荧光（荧光猝灭），同时也伴随着荧光寿命的相应缩短或延长。蛋白质磷酸化是细胞信号转导过程中的重要标志，研究其中的酶活性是研究信号通路的一个重要方面。利用放射性以及免疫化学发光等方法检测酶活性，都需要破碎细胞，用细胞提取物测定酶活性，无法做到活细胞内定时、定量、定位的观测酶活性变化，而利用FRET方法就可以很好的解决这个问题。利用FRET原理设计了一种新的探针（一种融合蛋白）：新探针包含一个对已知蛋白激酶特异性的底物结构域，一个与磷酸化底物结构域相结合的磷酸化识别结构域。这个探针蛋白的两端分别是供体、受体荧光分子，利用FRET原理工作。当底物结构域被磷酸化后，分子内部就会发生磷酸化识别结构域与其结合而引起的内部折叠，两个荧光蛋白相互靠近就会发生能量迁移。实验用到的供体是Thr46（铽标记的anti-phospho-4EBP1），受体是绿色荧光标记的4EBP1，是mTOR下游信号通路的蛋白，有活性的mTOR能磷酸化4EBP1，使之与供体结合。如果mTOR活性受到抑制，供体受体距离不能达到荧光能量转移的要求，则在515nm处与485nm处的信号比值增大。抑制剂的活性越大，比值越大。（3）均相时间分辨荧光（HTRF）我们找到的是HTRF ADP Transcreener试剂盒。HTRF Transcreener ADP测定是竞争性免疫测定。mTOR是一种激酶，在反应时会使ATP转化为ADP。ATP转化的ADP与d2标记ADP竞争性地与铕标记的ADP单克隆抗体结合。当铕标记的ADP单克隆抗体与有标记的ADP相结合后，他们便能发射荧光；当抗体与没有标记的细胞内ADP结合后，没有荧光产生。所以，通过检测荧光值的变化，便可量化细胞内的ADP。该测定法包括两个步骤：一个酶促步骤及随后的通用检测步骤。首先在激酶作用下，ATP转化成ADP；铕标记的抗体与加入的标记的ADP能发生能量转移，与反应中转化的ADP没有能量转移，检测不到荧光。所以荧光强度会随着反应转化的ADP量增加而减小。mTOR抑制剂活性越大，反应转化的ADP越少，荧光强度越强，通过作图计算IC50，可以比较不同抑制剂的活性。荧光检测还可以采用以下几种方法。 ADP Hunter试剂盒我们也可以直接检测激酶反应产生的ADP的量。ADP Hunter是一种高通量筛选激酶抑制剂的试剂盒。它的优点是更加简便和灵敏。此测定法直接检测磷酸化反应而产生的ADP分子，采用非放射性，非基于抗体的方法。激酶反应将ATP转化为ADP，通过偶联酶反应系统从ADP生成过氧化氢。在有过氧化氢酶（HRP）存在时，过氧化氢与ADHP（HRP显色底物）结合显色，用荧光酶标仪在最大激发波长和最大发射波长分别为530纳米和590纳米处检测荧光强度。 ADP-Glo是测定激酶活性的一种常用方法，检测也是激酶反应产生的ADP的量。在激酶反应后，把残留的未反应的ATP用酶降解，反应产生的ADP在酶作用下转化成ATP，最后在荧光素酶作用下检测荧光。不同浓度的ADP含量可做出的标准图，将最后的实验结果与标准图对照，可得出结论。在最下面的一条曲线表明磷酸化程度最弱，抑制剂的活性越强。 LabChip EZ Reader MSA assays这个方法跟之前的原理都略有不同，虽然最后也是检测荧光强度，但是它是把处理过的样品用荧光后标记吸入管中，根据不同带荷质比迁移率不同，荧光底物和荧光底物标记的检测物最后到达检测窗口的时间也不同，最后就能得到一幅关于时间与荧光强度的关系图。跟高效液相的过程有点类似，只不过高效液相是根据组分的极性不同，检测器是紫外。而这个方法是根据荷质比，检测方法是荧光。在试验中用到的样品可以是抑制剂处理过的mTOR下游靶蛋白，靶蛋白磷酸化程度越弱，则荧光信号越弱，抑制剂活性越强。（4）时间分辨荧光技术（TRF）时间分辨荧光技术的原理是用三价稀土离子及其螯合物作为示踪物，代替荧光物质、同位素、酶和化学发光物质，标记抗原、抗体、激素、核酸探针等物质。当免疫反应发生后，根据稀土离子螯合物的荧光光谱的特点 （特异性强、荧光光谱的Stokes位移、寿命长），用时间分辨荧光分析仪，测定免疫反应最后产物的荧光强度。根据荧光强度和相对荧光强度比值，判断反应体系中分析物的浓度，达到定量分析的目的。示踪剂一般是具有独特荧光特性的稀土金属-镧系元素，镧系元素共有15种，应用在时间分辨荧光免疫技术中有四种：铕(Eu)、钐（Sm)、镝(Dy)、锝(Te)。镧系元素荧光特点：（1）荧光寿命极长v 镧系元素螯合物（60900 us) v 普通荧光免疫中荧光团：1100usv 样本中蛋白质荧光：110us，易猝灭。（2）Stokes位移大（大约290nm）v 铕：发射光613nm、激发光340nm，v 荧光素的Stokes位移为28nm （3）荧光特异性强（发射光谱带很窄：615 5nm）（4）解离-增强技术可使其荧光性提高100万倍所以镧系元素有两个优点， stocks位移,也就是激发光和发射光距离很大,很容易分辨激发光和发射光，而排除激发光的干扰。第二个优点是镧系元素的荧光不仅强度高，而且半衰期也很长，通过时间分辨，极大地降低了自发荧光背景,实现了高信噪比。故我们在时间分辨荧光检测中一般会采用DELFIA法(解离增强镧系元素荧光免疫检测)。这一技术使用镧系螯合物标记的试剂，通过洗涤来分离出未被结合的试剂，从而检测体系中被标记的某种化合物或生物分子。在加入样品后经过洗脱，phospho-p70S6K抗体留在板上，再加入铕标记的Eu-anti-phospho-p70S6K 抗体经过洗脱，加入增强剂，Eu3+从复合物上解离下来，自由Eu3+在增强剂作用下在紫外光的激发下能发出很强的荧光，信号增强了百万倍。实验用处理过的mTOR与p70S6K一起培养一段时间，之后加入铕标价的磷酸化p70S6K抗体，在荧光下检测信号强度。信号强度越低表示磷酸化程度越低，mTOR活性越小，小分子抑制剂活性越大。DELFIA 优点包括：DELFIA 适用于各种标记分子的结合检测: 从小肽段至蛋白大分子；高灵敏度 -信噪比可达 20 000:1；大的动态范围 - 动态范围超过 3 logs；检测过程不涉及酶 无时间依赖性；试剂用量更少；价格不菲的抗体所需更少；无需像ELISA那样添加实验终止液；可同时检测多种待测物；减少了测量过程中的样品干扰；信号稳定超过24小时, 提高了试验重复性。（4）AlphascreenAlphascreen的作用原理：在Alphascreen系统中主要含有两种核心物质，一为Donor Bead，另一为Acceptor Bead，当Donor Bead所带有的A分子与Acceptor Bead所带有的B分子产生相互作用时，可以680nm镭射光去激发Donor Bead表面所带有的光敏感物质，使其催化周遭的氧分子形成活化态。此时活化态的氧分子可以与邻近的Acceptor Bead产生化学冷光化反应，并进一步藉由能量转换激发Acceptor Bead所带有的荧光物质产生520-620nm的荧光信号。当分子不存在特异的相互作用时，活化态的氧无法扩散到Acceptor Bead，则不会有信号的产生。AlphaScreen SureFire 检测试剂盒可用于 mTOR 通路的研究，由下图可见相关产品很多，方便用于mTOR抑制剂的筛选。与同类型的检测方法TR-FRET、EFC和FP相比，AlphaScreen的优势在于蛋白和多肽都可作为磷酸化底物用于激酶检测。 与ELISA相比，该检测方法最大的优势在于无需进行引物标记，检测灵敏度比ELISA方法更高。5. mTOR抑制剂的筛选方法的比较以上就是mTOR抑制剂几种筛选方法的介绍，最后对几种筛选方法进行简单的比较：1.ELISA操作简单快速，特异性强，没有放射性污染，设备要求简单，应用范围广。 2.荧光谐振能量转移法（FRET）操作简便，结果直观，但供体受体之间发生有效能量转移的条件是苛刻的，寻找一个合适的D-A对是很不容易的。采用ADP含量测定试剂盒更方便，灵敏度很高。3. DELFIA 适用于各种标记分子的结合检测,试剂用量少；价格不菲的抗体所需少,减少了测量过程中的样品干扰,灵敏度高。 4.Alphascreen实际上是ELISA+冷光信号放大测定，由于是类荧光检测所以比ELISA更灵敏，测量范围更广。ELISA的试用检验均可以应用。 参考文献1 朱伦，陈增良mTOR的结构域功能国际病理科学与临床杂志，2006,26(1)：31332 黄嘉佳， 林桐榆.mTOR通路及其抑制剂抗肿瘤的研究进展.癌症, 2007,26(12):1397-14013NoelD.DAngelo .DiscoveryandOptimizationofaSeriesofBenzothiazole Phosphoinositide 3-Kinase(PI3K)/MammalianTargetofRapamycin(mTOR)DualInhibitors . J.Med.Chem.2011,54,178918114 Craig S. Takeuchi .Discovery of a Novel Class of Highly Potent, Selective, ATP-Competitive, and Orally Bioavailable Inhibitors of the Mammalian Target of Rapamycin (mTOR) . J. Med. Chem. 2013, 56, 221822345 JohnBarker. Steady-State Kinetic and Inhibition Studies of the Mammalian Target of Rapamycin (mTOR) Kinase Domain and mTOR Complexes. Biochemistry2010,49,848884986 参考网址/Resources/TechnicalResources/A