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文档简介

产品简介: 1. MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(MTT Cell Proliferation and Cytotoxicity Assay Kit)被广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的实验方法。由于细胞活力与细胞数呈正相关,因此常常用来检测细胞的增殖情况。MTT可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成结晶状的深紫色产物formazan。在特定溶剂存在的情况下,可以被完全溶解。然后通过酶标仪可以测定570nm波长附近的吸光度。细胞增殖越多越快,则吸光度越高;细胞毒性越大,则吸光度越低。 2. 本试剂盒采用了独特的Formazan溶解液配方,无需去除原有的培养液,可以直接加入Formazan溶解液溶解formazan。从而避免了由于去除培养液时formazan被部分去除而引起的误差。 3. 本试剂盒背景低,灵敏度高,线性范围宽,使用方便提高了可靠性。4. 本产品为500 次(5个96孔细胞培养板)操作。 产品内容: MTT染色液 5mlFormazan溶解液 55ml说明书 1份保存条件: MTT染色液需-20避光保存;Formazan溶解液可以室温保存。 注意事项: 1. 由于使用96孔板进行检测,如果你的细胞要养48 h或更长,建议不要吝啬96-孔板的四周边孔,这32个边孔不能使用,建议加入灭菌PBS以饱和中间64个孔的水分。因为细胞培养过程中,边孔的水分蒸发很快,培养液及里面的药物会出现浓缩现象,细胞的状况就复杂了2. MTT溶剂在低温情况下会凝固,使用前请室温放置或20-25水浴温育片刻至全部融解后使用。 3. MTT一般最好4C避光保存两周内有效,保存在-20度长期保存,避免反复冻融,最好小剂量分装,用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。 4. Formazan溶解液结冻或产生沉淀时可以37水浴孵育以促进溶解,并且必须在全部溶解并混匀后使用。 5. 孵育时,须避光6. MTT有致癌性,用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌,MTT对菌很敏感。 使用说明: 1. 收集对数期细胞,调整细胞悬液浓度,每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔,(边缘孔用无菌PBS填充)。2. 5%CO2,37孵育,至细胞单层铺满孔底(96孔平底板,具体每孔所用的细胞的数目,需根据细胞的大小,细胞增殖速度的快慢等决定)。加入浓度梯度的药物,原则上,细胞贴壁后即可加药,或两小时,或半天时间,每孔0-10ul,设3-5个复孔.建议设5个。3. 5%CO2,37孵育16-48小时,倒置显微镜下观察。4. 每孔加入10微升MTT染色液,继续培养4h。若药物与MTT能够反应,可先离心后弃去培养液,小心用PBS冲2-3遍后,再加入含MTT的培养液。5. 每孔加入100微升Formanzan溶解液,置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪570nm测定吸光度。如无570nm滤光片,可以使用560-600nm的滤光片。6. 同时设置调零孔(培养基、MTT染色液、Formanzan溶解液),对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT染色液、Formanzan溶解液)MTT法什么是MTT法?又称MTT比色法,是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒,用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值,可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内,MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。 MTT法 - 缺点:由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水,需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加,也会对实验结果的准确性产生影响,而且溶解甲瓒的有机溶剂对实验者也有损害。MTT法 - MTT 溶液的配制方法通常,此法中的MTT 浓度为5mg/ml。因此,可以称取MTT 0.5克,溶于100 ml的磷酸缓冲液(PBS)或无酚红的培养基中,用0.22m滤膜过滤以除去溶液里的细菌,放4 避光保存即可。在配制和保存的过程中,容器最好用铝箔纸包住。MTT法 - 注意事项MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力,但不能测定细胞绝对数。在用酶标仪检测结果的时候,为了保证实验结果的线性,MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。MTT一般最好现用现配,过滤后4C避光保存两周内有效,或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存,避免反复冻融,最好小剂量分装,用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分装在EP管里,用的时候现配,直接往培养板中加,没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。MTT有致癌性,用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌,MTT对菌很敏感;往96孔板加时不避光也没有关系,毕竟时间较短,或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉.配制MTT时用用PBS溶解,也有人用生理盐水配,60水浴助溶。PBS配方:Nacl 8gKcl 0.2gNa2HPO4 1.44gKH2PO4 0.24g调pH 7.4定容1LMTT法 - MTT法实验步骤贴壁细胞:1、收集对数期细胞,调整细胞悬液浓度,每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔,(边缘孔用无菌PBS填充)。2.、5%CO2,37孵育,至细胞单层铺满孔底(96孔平底板),加入浓度梯度的药物,原则上,细胞贴壁后即可加药,或两小时,或半天时间,但我们常在前一天下午铺板,次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个,否则难以反应真实情况3.、5%CO2,37孵育16-48小时,倒置显微镜下观察。4、每孔加入20ulMTT溶液(5mg/ml,即0.5%MTT),继续培养4h。若药物与MTT能够反应,可先离心后弃去培养液,小心用PBS冲2-3遍后,再加入含MTT的培养液。5、终止培养,小心吸去孔内培养液。6、每孔加入150ul二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。7、同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜),对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)悬浮细胞:1、收集对数期细胞,调节细胞悬液浓(储存液100 1640)。mg/ml,需预试寻找最佳稀释度,1:10-1:20);需检测物10ul;细胞悬液50ul(即5104cell/孔),共100ul加入到96孔板(边缘孔用无菌水填充)。每板设对照(加100m度1106/ml,按次序将补足的1640(无血清)培养基40ul ;加Actinomycin D(有毒性)10ul用培养液稀释 l2、置37,5%CO2孵育16-48小时,倒置显微镜下观察。3、每孔加入10 ul MTT溶液(5 mg/ml,即0.5%MTT),继续培养4 h。(悬浮细胞推荐使用WST-1,培养4 h后可跳过步骤4),直接酶联免疫检测仪OD570nm(630nm校准)测量各孔的吸光值)4、离心

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