温州医学院《分析化学》18-高效液相色谱

1,第十八章高效液相色谱法HighPerformanceliquidChromatography(HPLC),2,18.1概述,高效液相色谱法（HPLC）：在经典液相色谱的基础上，引入了气相色谱法的理论和实验方法，采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，发展而成的一种现代液相色谱分析方法。,一、HPLC与GC差别二、特点,3,一、HPLC与GC差别,相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测主要差别：分析对象的差别和流动相的差别,1分析对象GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品不可检测占有机物的20%HPLC：溶解后能制成溶液的样品，不受样品挥发性和热稳定性的限制,分子量大、难气化、热稳定性差及高分子和离子型样品均可检测用途广泛占有机物的80%,4,GC：流动相为惰性气体流动相与组分无亲合作用力，仅起运载作用；组分只与固定相作用HPLC：流动相为液体流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、改善分离度增加了因素，对分离起很大作用流动相种类较多，选择余地广流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相可以增大分离选择性,2流动相差别,5,二、HPLC的特点,适用范围广（可分析80%有机化合物，广泛应用于各种药物及其制剂的分析测定）分离性能好分析速度快流动相可选择性范围宽灵敏度高色谱柱可反复使用（与经典色谱相比）流出组分容易收集安全,6,18.2HPLC的分类和基本原理,18.2.1HPLC的分类,1按固定相的聚集状态分：液-液色谱法（LLC）和液-固色谱法（LSC）,2按分离机制分：,分配色谱吸附色谱离子交换色谱分子排阻色谱化学键合相色谱亲合色谱手性色谱,7,18.2.1基本原理,塔板理论速率理论,在高效液相色谱中,液体的扩散系数仅为气体的万分之一，则速率方程中的分子扩散项B/u较小，可以忽略不计，即：H=A+B/u+CuH=A+Cu故液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同，如图所示。,经典液相色谱法,+,气相色谱法,液体的粘度比气体大一百倍，密度为气体的一千倍，故降低传质阻抗是提高柱效主要途径,8,采用小粒度、窄分布的球形固定相，均匀装柱。A采用低黏度流动相，低流速。C，u液相色谱中，不可能通过增加柱温来改善传质。一般恒温操作。,H=A+Cu,由VanDeemter方程式可以获得HPLC分离条件：,9,18.3各类高效液相色谱法,18.3.2液-液分配色谱法,根据流动相与固定相极性的差别，可将液-液色谱分为,极性小的先流出，适于极性组分分离,正相液-液色谱流动相极性BC,正、反相色谱中极性和保留时间的关系,14,B+H+BH+,+,RSO3NaRSO3-+Na+,BH+RSO3-,|,BH+RSO3-,3.反相离子对色谱（RPIC）,（1）分离机理,以分析碱类物质B为例,流动相,固定相,（PICB）,中性离子对,15,（2）常用离子对试剂,烷基磺酸钠分析碱（正电荷）四丁基季铵盐分析酸（负电荷）,a与流动相的极性有关（同反相色谱）b与R的链长有关：R长，极性，k，tR,（3）影响k的因素,（4）适用：有机酸、碱、盐，离子型和非离子型化合物的混合物。在药物分析中应用很广,16,4.离子抑制色谱（ISC）,在反相色谱法中，通过调节流动相的pH，抑制样品组分的解离，增加它在固定相中的溶解度，以达到分离有机弱酸、弱碱的目的，称为离子抑制色谱法（ISC）,（1）适用范围,弱酸3.0pKa7.0弱碱7.0pKa8.0,（2）抑制剂,弱酸（乙酸）、弱碱（氨水）或缓冲盐,（3）影响k的因素,a与流动相的极性有关（同反相色谱）b与流动相pH有关：弱酸pHpKak，tR弱碱反之,17,7种四环素类抗生素对照品,色谱柱：C18（250mm*4.6mm，5m）流动相：甲醇-乙腈-0.01mol/L草酸溶液（pH2.0）（11:12:67,V/V/V）,检测器：UV267nm,18,其分离原理与离子交换色谱原理一样，电导检测器检测。问题：由于流动相都是强电解质，其电导率比待测离子约高2个数量级，这种强背景电导会完全掩盖待测离子信号。,5.离子色谱,1975年Small提出，在离子交换柱之后，再串结一根抑制柱。该柱装填与分离柱电荷完全相反的离子交换树脂。通过分离柱后的样品再经过抑制柱，使具有高背景电导的流动相转变为低背景电导的流动相，从而可用电导检测器检测各种离子的含量。,19,例：分析阴离子时，以NaOH为流动相，抑制柱为高容量的强酸性阳离子交换树脂，则发生下列反应：分离柱：交换反应：R+OH-+NaXR+X-+NaOH洗脱反应：R+X-+NaOHR+OH-+NaX抑制柱：与组分反应：R-H+NaXR-Na+HX与洗脱液反应：R-H+NaOHR-Na+H2O,20,原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。,先在载体表面键合上一种具有一般反应性能的所谓间隔臂(环氧、联胺等)，再连接上配基(酶、抗原等)，这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改变淋洗液后洗脱。,6.亲合色谱,21,7.手性色谱,原理：对映异构体与手性选择物形成瞬间非对映立体异构“配合物”，由于两对映异构体形成的“配合物”的稳定性不同，因而得到分离。,22,18.4固定相,18.4.1液-固色谱固定相,大多具有吸附活性的吸附剂。常用的有硅胶、氧化铝以及高分子多孔微球,1.硅胶,无定形全多孔硅胶，球形全多孔硅胶、堆积硅珠,2.高分子多孔微球,由苯乙烯与二乙烯苯交联而成,23,化学键合固定相:目前应用最广、性能最佳的固定相；一般的键合相用硅胶为载体：a.硅氧碳键型：SiOCb.硅氧硅碳键型：SiOSiC(ODS）（P502）,18.4.2化学键合相,1.非极性键合相键合相表面基团为非极性烃基，如C18、C8、C1和苯基等。一般用于反相色谱,24,（1）载体性质,多数产品采用全多孔YWG、YQG或堆积硅珠作载体,YQG-C18H37（5m）、YWG-C6H5（10m）NucieosilC18、Zorbax-ODS,（2）表面覆盖度,参加反应的硅醇基数目占硅胶表面硅醇基总数的比例覆盖度的大小，决定是分配还是吸附作用占主导。,（3）键合基团的链长,链长、极性、载样量、k值,25,时间，min,固定相：C1,固定相：C8,固定相：C18,硅胶-烷基键合相中烷基链长对反相色谱分离的影响1-尿嘧啶；2-苯酚；3-乙酰苯；4-硝基苯；5-苯甲酸甲酯；6-甲苯,可见：反相键合色谱中，键合相碳链越长，分离效果越好。,26,常见的有醚基和二羟基键合相。此类固定相应用较少。,2.中等极性键合相,3.极性键合相,常用极性键合相为氨基键合相（强极性）、氰基（中强极性）键合相。一般用于正相色谱。,27,流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况。,不与固定相发生化学反应对试样有适宜的溶解度，k=25纯度要高，粘度要小必须与检测器相适应,18.5流动相（溶剂系统）,流动相的基本要求,28,18.5.1分离方程式,主要受溶剂种类的影响k主要由溶剂的配比所决定,29,18.5.2Snyder溶剂分类,Snyder选了三个参考物质，用于检验溶剂的三种分子间作用力，分别用Xe、Xd及Xn表述。将81种色谱常用溶剂，按Xe、Xd及Xn在三角形坐标图上的相邻关系分为八类（组）,30,表中的P代表在正相色谱与硅胶吸附色谱法中溶剂的极性。P大，洗脱能力大。Xe、Xd与Xn为三种作用力的相对值，三者之和为1。其数值的大小，表示作用力的强弱。,31,质子给予体,偶极相互作用,质子接受体,溶剂选择性分类三角形图,Xe,Xd,Xn,1,2,3,4,5,6,7,8,纯质子接受体,强偶极中性化合物,纯质子给予体,32,1组：脂肪醚（纯质子接受体）2组：脂肪醇（质子接受-给予体）3组：吡啶衍生物、四氢呋喃（质子接受体，易极化）4组：乙二醇、苄醇、乙酸、甲酰胺（质子给予体）5组：二氯甲烷、二氯乙烷（大偶极距）6组：脂肪酮、酯、二氧六环、腈7组：芳烃、芳醚、硝基化合物8组：氟代醇、氯仿、水（质子给予体）,33,流动相类别,按流动相组成分：单组分和多组分；按极性分：极性、弱极性、非极性；按使用方式分：等度洗脱和梯度洗脱。常用溶剂：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、甲醇、水。采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。,34,3.流动相选择,采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。,在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。,正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强,35,选择流动相时应注意的几个问题,（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。,（2）使用前需要用微孔滤膜过滤，除去固体颗粒。,（3）流动相使用前最好脱气。,36,18.6高效液相色谱仪,37,输液系统,进样系统,色谱柱系统,检测系统,温控系统,记录系统,液相色谱法的一般流程简略图,38,1.柱塞往复泵无脉动流量恒定能自由调节流量耐高压耐腐蚀等特性,18.6.1输液泵,39,2.梯度洗脱装置,高压二元梯度:利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。,低压梯度:在常压下,通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。,40,18.6.2进样器与色谱柱,1.进样器,流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置,41,2.色谱柱,柱体为直型不锈钢管，内径24.6mm，柱长1025cm。,3.色谱柱柱效的评价,药典规定，用HPLC建立分析方法时，需进行“系统适用性试验”最小理论塔板数、分离度、重复性和拖尾因子,42,18.6.3液相色谱检测器,特点：灵敏度高；噪音低；不破坏样品；对流动相的流速和温度波动不敏感；可用于梯度洗脱属于浓度型检测器,1.紫外检测器,应用最广，对大部分有机化合物有响应。,43,紫外检测器的弱点,只能检测有紫外吸收的样品流动相的选择有一定的限制，检测波长须大于流动相的截止波长,截止波长,紫外检测器的类型,用1cm光径的吸收池装待测溶剂，用空气作参比，改变照射波长，当吸光值A=1时，此时的波长称为该溶剂的截止波长,固定波长、可变波长、光电二极管阵列,44,（3）光电二极管阵列检测器（DAD）,紫外检测器的重要进展；光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。,45,46,光电二极管阵列检测器,47,2.荧光检测器（FD）,高灵敏度、高选择性；只适用于产生荧光或其衍生物能发荧光的物质对氨基酸、多环芳烃，维生素、甾体化合物及酶类等有响应常用于体内药物分析,48,3.蒸发光散射检测器（ELSD）,49,（2）安培检测器,电化学检测器之一，利用组分的氧化反应产生的电流变化，而进行检测。凡有氧化还原活性的物质都能检测。,4.其他检测器,（1）化学发光检测器,待测物,+,发光试剂,激发态的产物,基态,发射光子,50,18.8HPLC的应用,1.环境中有机氯农药