4色谱-HPICppt课件.ppt

2020/5/3,1,第四章离子色谱,姚彤炜,2020/5/3,2,一、概述,离子色谱（ionchromatography，IC）是由经典的离子交换色谱发展而成的一种液相色谱技术。利用物质在离子交换柱上迁移的差异而达到分离，用于亲水性阴阳离子的测定1975年Small等人在分析柱后接一根抑制柱来扣除背景电导（即淋洗液离子），采用通用而灵敏的电导检测器检测，使离子交换色谱第一次能够快速分离和测定常见无机和有机阴离子。后来就把这种方法称为离子色谱法,2020/5/3,3,离子色谱（IC）在性能上的改进,采用高效离子交换树脂和色谱柱树脂具有均匀的粒度，直径约为550m，离子交换剂是球形有机树脂或带有键合离子交换相的多孔二氧化硅材料，交换柱内径为25mm，柱长为1025cm样品体积小一般进样量为50l，采用定量管进样。测定的样品浓度范围是ppmppb级较好的色谱仪部件和被测组分的自动检测,2020/5/3,4,离子色谱的应用,离子色谱自1975年问世以来，已有了惊人的发展。目前离子色谱已广泛应用于环境、水文地质、能源、化工冶金、半导体、食品、饮料、生命科学等有关领域主要用于无机阴阳离子、有机酸、糖醇类、氨基糖类、氨基酸、核酸、蛋白质、糖蛋白等物质的定性和定量分析。在超纯分析、价态和形态分析方面，离子色谱法显示出独特的优越性2010年版中国药典收载了离子色谱法,2020/5/3,5,离子色谱分离方式,根据分离机理不同，IC的分离方式可分为：高效离子色谱（HPIC）离子交换用于无机阴阳离子、羧酸化合物(甲酸、乙酸、酒石酸、草酸等)、碳水化合物、胺类化合物分析高效离子排斥色谱（HPICE）离子排斥用于有机酸、氨基酸等分析，以及从有机物中分离无机组分流动相离子对色谱(MPIC)吸附和离子对的形成用于疏水性阴、阳离子以及金属络合物等的分离,如Fe(CN)63-，BF4-，SCN-，I-，ClO4-等,2020/5/3,6,离子色谱系统,采用全塑料系统，无脉冲双往复泵，用微处理机控制泵速和温度补偿，可在pH014范围内使用,2020/5/3,7,离子色谱的塔板理论与分离度,离子色谱法属于高效液相色谱法的一种，其色谱峰迁移和扩展可用柱色谱理论进行描述。用理论板数N来衡量柱效：N=5.54(tR/w0.5)2=16(tR/w)2N=L/H分离度的表示方法以及与柱效的关系均与高效液相色谱相同,2020/5/3,8,离子色谱固定相（离子交换剂）,作为离子色谱固定相的离子交换剂是一类带有离子交换功能基的固体微粒，其结构是在高分子骨架上结合可解离的无机基团，在离子交换反应中，离子交换剂的本体结构不发生明显变化，仅由其带有的离子与外界同电性离子发生等当量数的离子交换色谱柱填充剂有：有机聚合物载体和无机载体两种，前者应用广泛，如由苯乙烯-二乙烯基苯共聚物制得的离子交换树脂填料;无机载体一般为硅胶,2020/5/3,9,离子的选择性系数,在阴离子交换树脂上，阴离子的选择性系数(KAB)次序:ClO-4I-HSO-4SCN-CCl3COO-CF3COO-=NO-3=Br-NO-2=CN-Cl-BrO-3OH-HCO-3H2PO-4IO-3CH3COO-F-在阳离子交换树脂上，阳离子的选择性系数(KAB)次序:Th4+Fe3+Al3+Ba2+pb2+Sr2+Ca2+Co2+Cu2+Zn2+=Mg2+Mn2+Ag+Cs+K+NH+4Na+H+Li+,2020/5/3,10,对各种离子选择系数估计的一般原则,高价离子当量体积较小的离子极化度较大的离子与固定相相互作用较强的离子与淋洗液中其它成分相互作用弱的离子以上离子有较大的选择性系数,同价离子，浓度相同时，随原子量增加与树脂的亲和力增加，因为离子的水合离子半径随着原子量增加而降低不同价态离子，价态高的离子亲和力强,2020/5/3,11,常用淋洗液,分离阴离子用的淋洗液弱酸的碱金属盐或碱溶液（例NaOH，Na2CO3/NaHCO3溶液）分离阳离子用的淋洗液甲烷磺酸溶液、无机酸溶液（例HCl，HNO3溶液）分离过渡金属离子常用的淋洗液添加有机络合剂的淋洗液（例EDTA，酒石酸盐，柠檬酸盐，乳酸盐，-羟基异丁酸盐等）通过增加或减少洗脱液中酸碱溶液的浓度可以改变洗脱液的洗脱能力，也可在洗脱液中加入适当比例的甲醇、乙腈等有机改性剂，以改善色谱峰峰形,2020/5/3,12,检测器,通用检测器（总体性能检测器）对所有离子都有响应。例电导检测器选择性检测器（溶质专一性检测器）只对某些离子有响应。例紫外-可见检测器，安培检测器,2020/5/3,13,电导检测器,电导检测器是离子色谱中使用最广泛的检测器，可用于各种离子的检测，对分子物质如水、醇或未解离的弱酸分子没有响应，检测池体积小,将电解质溶液置于施加电场的两个电极间，溶液导电，其电导值(电阻R的倒数)1/R与电极截面积A、两极间距离L和各离子电导的总和Cii之间有以下关系：1/R=1/1000A/LCiICi为离子的当量浓度，i为离子的当量电导,2020/5/3,14,紫外-可见光度检测器,光度检测器具有以下优点：选择性好通用性好（直接、间接、柱后衍生化法）线性范围广（105）基本原理Beer-Lambert定律要求淋洗液中离子应具有低的值，而样品离子应具有高的值,2020/5/3,15,两种检测器串联使用,紫外光度检测器和电导检测器串联使用，可灵敏地检测一些对电导不敏感的组分，也可更有效地确定复杂样品定性的正确性紫外检测器与抑制型电导检测器串联使用时，紫外检测器可放在抑制柱前或后。当波长小于220nm时，应把比色池放在抑制柱后，以消除淋洗液的干扰,2020/5/3,16,二、高效离子色谱（HPIC）,HPIC的分离机制是离子交换，是离子色谱法的主要分离方式，用于亲水性阴阳离子的测定。根据是否采用抑制柱又可分为：抑制型离子色谱非抑制型离子色谱（单柱离子色谱）,2020/5/3,17,阳离子交换树脂,使用薄壳型树脂，树脂核是椭性而疏水的苯乙烯/二乙烯基苯的共聚物，核的表面是磺化层，磺酸功能基以共价键与树脂核共聚物相连,2020/5/3,18,阴离子交换树脂,树脂核与阳离子相同，核外是一层磺化层，其作用是提供一个以离子键结合的表面。最外层为粒度均匀的单层季铵化阴离子胶乳微粒,2020/5/3,19,离子交换机理,淋洗液中含有一定量与树脂的离子电荷相反的平衡离子。在离子交换过程中，流动相连续提供平衡离子，与树脂以离子对的形式处于平衡状态，保持体系的电荷平衡当样品离子进入色谱柱后，就与平衡离子交换，由于样品离子对树脂的亲和力，使样品离子在树脂上有一个短暂的停留，样品离子的亲和力不同，在柱中停留时间不同，迁移速度也不同，经一定时间后达到分离,2020/5/3,20,离子交换过程,A-R-N+R3-HCO3-R-N+R3-A-HCO3-淋洗离子淋洗离子M+R-SO3-H+R-SO3-M+H+淋洗离子淋洗离子K=K是选择性系数，K值越大，样品离子的保留时间越长。其值受多种因素影响,2020/5/3,21,影响离子洗脱顺序的因素,离子电荷:样品离子的价数越高，对离子交换树脂的亲和力越大。SCN-例外，其离子半径大，可极化，与阴离子交换树脂间有很强的吸引力离子半径:电荷数相同的离子，离子半径越大（易极化），对树脂的亲和力越大，保留时间越长例卤素的洗脱顺序为：F-Cl-Br-I碱金属的洗脱顺序为：Li+Na+K+,2020/5/3,22,影响离子洗脱顺序的因素,淋洗液pH:影响多价离子的分配平衡提高淋洗液pH，可使磷酸根从一价变为三价。因此在不同pH时，其洗脱的顺序不同树脂种类:离子交换树脂的交联度、功能基及其亲水性的大小等对离子分离的选择性起了很大作用对于疏水性强的离子不宜用疏水性柱，因为保留时间太长，应选用亲水性强的柱,2020/5/3,23,抑制反应和抑制柱,离子色谱法的基础是抑制柱反应。它是构成离子色谱的高灵敏度和选择性的重要因素，也是选择分离柱、抑制柱和淋洗液时必须考虑的重要因素抑制反应在离子色谱中所用淋洗液是离子型水溶液，用电导检测器检测时，淋洗液信号强，掩盖了样品离子产生的信号，即本底高、样品信号小，信噪比小，难以识别样品离子所产生的信号,2020/5/3,24,抑制柱,Small等人提出了一个办法，在分离柱和检测器之间加一个柱子，如果分离阴离子，则加一个H+型强酸性阳离子交换树脂柱；若分析阳离子，则加一个OH-型强碱性阴离子交换树脂柱。这样淋洗液中离子被中和，降低了本底电导值。这种柱称为抑制柱,2020/5/3,25,Na+OH-Na+Cl-,分析柱,H2OHCl,抑制柱作用原理,分析柱,阴离子（Cl-）分析：氢氧化钠或碳酸盐为淋洗液,HClNaCl,H2ONaOH,阳离子（Na+）分析：盐酸为淋洗液,2020/5/3,26,抑制柱作用原理,在抑制柱上发生了两个重要的反应：淋洗液中碱或酸变成了水被测离子变成了响应的酸或碱抑制柱起了两个重要作用：将样品离子转变成响应的酸碱后，检测灵敏度大大提高将淋洗液转变成水或很弱的酸，使本底大大降低以上两个作用同时改善了信噪比，提高了检测灵敏度,2020/5/3,27,水溶液中离子的极限当量电导,2020/5/3,28,抑制作用举例,用NaOH为淋洗液，抑制前淋洗液NaOH：50+198=248样品NaCl：50+76=126抑制后淋洗液NaOHH2O，电导由2480样品NaClHCl，电导由126426,2020/5/3,29,淋洗液,淋洗液必须具备两个必要条件能从分离柱树脂置换被测离子能发生抑制柱反应，反应产物为电导很低的弱电解质（pKa6）或水制备洗脱液的去离子水应经过纯化处理，电阻率一般大于18.2M,使用的洗脱液需经脱气处理,2020/5/3,30,常见阴离子淋洗液,2020/5/3,31,2020/5/3,32,常见阳离子淋洗液,HCl用于淋洗一价阳离子HCl/间苯二胺用于淋洗碱土金属离子甲磺酸（CH3SO3H）作淋洗液，可同时分离碱金属和碱土金属,2020/5/3,33,2020/5/3,34,非抑制型离子色谱,继抑制型离子色谱后，1979年，Gjerde和Fritz提出了一种不用抑制柱分析无机离子的液相色谱法。直接用电导池检测，此后发展为单柱离子色谱法单柱离子色谱的特点：用低容量大孔型阴离子交换树脂为填料选用低电导的淋洗液，如苯甲酸盐，邻苯二甲酸盐（分离阴离子），二乙胺盐（分离阳离子）样品峰有正、负可测定过渡元素和稀土元素灵敏度较差,2020/5/3,35,三、高效离子排斥色谱（HPICE）,该法是利用Donnan排斥效应而建立起来的一种离子色谱技术例如在阴离子的HPICE中，采用H型高容量阳离子交换树脂，样品阴离子受到Donnan排斥，不能进入树脂微孔，不被保留。而非离子型组分则不受Donnan排斥，可进入树脂孔而被保留所谓Donnan排斥是指树脂的离子交换位置上的电荷与被测离子相同，使被测离子进入树脂微孔时受到阻碍，只能从树脂颗粒间隙间通过,2020/5/3,36,离子排斥色谱分离原理,基于溶质进入树脂微孔的扩散能力。改变溶质的解离度可改变其保留时间。引起溶质的解离度变化的因素有：淋洗液pH值溶质的pKa溶质的浓度树脂的性质温度、流速等,2020/5/3,37,四、流动相离子对色谱（MPIC）,本法采用疏水性固定相，具有反相离子对色谱的高分离效率、高选择性和抑制型电导检测器离子色谱的高灵敏度，可用于分离多种阴、阳离子，特别是疏水性的阴阳离子MPIC的柱填料是高交联度、高比表面积的中性无离子交换功能基的聚苯乙烯大孔树脂,2020/5/3,38,常用的离子对试剂,阳离子分离：脂肪族磺酸(丁、戊、己、庚、辛烷磺酸，十二烷基磺酸，甲苯磺酸，樟脑磺酸等)阴离子分离：季铵化合物（氢氧化四甲铵、四乙铵、四丁铵等）流动相中加入乙腈、甲醇、异丙醇等有机改性剂可增加淋洗液的疏水性，从而改变离子对对固定相的亲和力，减短保留时间流动相的pH对离子对的形成有很大的影响，必须保证待测离子以离子状态存在。同时还要考虑在此pH下是否有副反应发生,2020/5/3,39,2010年版中国药典附录规定,离子色谱法的色谱柱填充剂大多不兼容有机溶剂，且污染后不能用有机溶剂清洗，因此，离子色谱法对样品处理的要求较高对于基质简单的澄清水溶液一般通过稀释和0.45m滤膜过滤后可直接进样分析对于基质复杂的样品，可以采用微波消解、紫外光降解、固体萃取等方法除去干扰后进样分析,2020/5/3,40,离子色谱法系统适用性试验要求,与高效液相色谱法相同测定方法主要有：内标法外标法面积归一化法标准曲线法,2020/5/3,41,应用示例,高效离子交换色谱和脉冲安培检测器测定糖醇糖醇有甜味而无热量，在糖果生产中用作甜味剂。如减肥食品中常用山梨醇和甘露醇代替蔗糖，但因其有轻泻性和利尿性，故在食品中的用量有一定限制采用高效高容量的阴离子交换柱CarbopacMA1，其对糖醇有独特的选择性，可用高浓度的NaOH为淋洗液，用脉冲安培检测器检测,2020/5/3,42,糖醇的洗脱顺序,洗脱顺序取决于pKa值，高pKa的糖醇先被洗脱，依次为单糖和有低pKa的双糖等,1肌糖（纤维糖）2木糖醇3山梨糖醇4甘露醇5葡萄糖6果糖7蔗糖,2020/5/3,43,复方氨基酸注射液中乙酸的IC测定,乙酸为注射液中添加的用来电荷平衡的，于正常生理状态下的血清中存在并可实现自身代谢。进口复方氨基酸注射液选择定量加入乙酸以达电荷平衡，并将其作为一种活性成分来控制含量。仪器与色谱条件：ICS1000型离子色谱仪(美国戴安公司)；色谱柱DionexIonPacICE-AS1柱(9x250mm)；抑制器AMMS-ICEII(4mm)；淋洗液0.5mmol/L辛烷磺酸，流速1.0ml/min；再生液5mmol/L四丁基氢氧化铵，流速2.0ml/min；电导检测器；柱温室温；进样量25l。,2020/5/3,44,结果色谱图,实验条件下，处方中各种氨基酸、PO43-、C1-均不干扰乙酸的测定,空白制剂溶液,对照品溶液,供试品溶液,乙酸,乙酸,2020/5/3,45,离子色谱一抑制电导检测法同时测定唑尼沙胺原料中有关杂质,仪器与色谱条件：Dionex100型离子色谱仪，配有电导检测、自再生抑制器(DionexASRS-ULTRA，4mm)、英谱色谱工作站；色谱柱：DionexIonpacAS4A-SC型阴离子分析柱；淋洗液：0.3mmol/LNa2CO3与1.6mmol/LNaHCO3的混合溶液；流速1.0mL/min；进样体积50L。有关杂质：中间体BOS-Na和BOA-H、Cl-和SO42-,2020/5/3,46,检测结果,建立的方法可同时测定样品中中间体杂质和无机离子。外标法测得有关杂质的含量为BOS-Na2.11mg/g，BOA-H0.51mg/g，Cl-3.77mg/g,2020/5/3,47,离子色谱-电感耦合等离子体质谱联用检测尿样中的三价铬和六价铬,三价铬是人体必需的微量元素，是正常糖脂代谢所不可缺少的，缺铬会引起动脉硬化等多种疾病；而六价铬由于其氧化性和对皮肤的高渗透性，毒害很大，被确认有致癌作用。因此，只有分别测量其中三价铬和六价铬，才能说明其对环境和动植物的毒害程度，仅对铬做总量分析是不完善的。单独离子色谱法测定灵敏度不够，与电感耦