级基因工程期末复习材料

基因工程复习题绪论基因工程按照人们的的愿望，进行严密的设计，通过体外DNA重组和转基因等技术，有目的地改造生物种性，使现有的物种在较短时间内趋于完善，创造出更符合人们需求的心的生物类型，这就是基因工程。又称重组DNA技术或遗传工程基因工程的操作步骤可简单概括为分、切、接、转、筛、增基因工程特点在分子水平表达和细胞水平操作表达构建克隆载体是基因工程技术路线中的核心环节基因工程工具酶指体外进行DNA合成、切割、修饰和连接等系列过程中所需的酶，包括DNA聚合酶、限制性核酸内切酶、修饰酶和连接酶。限制性核酸内切酶和连接酶是基因工程关键的工具酶。现在常用的DNA连接酶只有2种，即大肠杆菌DNA连接酶和T4DNA连接酶现代分子生物学领域理论上三大发现和三大发明对基因工程的诞生起决定作用三大发现（1）DNA是遗传物质（2）揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机理（3）遗传密码的破译和遗传信息传递方式的确定三大发明（1）限制性核酸内切酶的发现与DNA切割（2）DNA连接酶的发现与DNA片段的连接（3）DNA重组基因工程载体的研究与应用实验中为什幺要筛选白斑，即原理是什么有外源DNA片段插入到位于LACZ的多克隆位点后，就会破坏肽链的读码框，从而不能形成有功能活性的半乳糖苷酶，因此含有重组质粒的克隆往往是白色菌落DNA重组试验中为什么用IPTG不用乳糖因为培养基中的乳糖会被诱导合成的半乳糖苷酶所催化降解，从而使其浓度不断发生变化。常用异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）、硫甲基半乳糖苷TMG第一章核酸的制备知识点生物体内的DNA绝大部分是BDNA形式存在，（A、B、ZDNA）如何获得完整的DNA分子或大的DNA片段，是DNA制备中的一项关键技术。每一种生物DNA的复制总是从特定位点起始，这个位点具有一点的核苷酸序列。将此核苷酸序列区称为复制起始位点DNA的转录应包含转录启动子和转录区1121处为起录点。在原核生物结构基因的起录点下游不远处，总有一个5AGGAGG3的序列，转录出MRNA上的5AGGAGG3序列，与核糖30S亚基16SRRNA3端是5CCUCCU3互补成为30S亚基识别和结合MRNA的位点，把此序列称为SD序列。真核生物基因转录区部不有SD序列的互补序列几乎所有真核生物的染色体DNA都是线形DNA,部分原核生物的染色体DNA也是以线形存在的。而大部分原核生物的染色体DNA和全部线粒体DNA、叶绿体DNA以及细菌的质粒DNA全是环状DNA分子。环状DNA分子一般以超螺旋形式即CCCDNA，DNA一条链的一个磷酸时为开环DNA分子（OCDNA）DNA两条链中相对应的两个磷酸二酯键同时断开时为线形DNA（LDNA）拷贝数指某目的基因在某一生物群体或个体中存在的个数单拷贝就是该基因在基因组中只有一个,多则指有多个。不同构型质粒DNA电泳图核酸分离纯化是原则A保持核酸分子以及结构的完整性B防止核酸的生物降解核酸分离纯化的一般程序材料的选择与预处理破碎细胞与提取分离纯化DNA纯化最常用的方法是乙醇沉淀（同时含有NA离子）、DNA沉淀可用玻璃棒挑或者离心沉淀DNA凝胶电泳的影响因素带电颗粒的物理性状，支持物介质，电泳强度，缓冲液离子强度凝胶染色EB液/SYBRGREEN/GOLDVIEW核酸分子杂交技术基本原理具有一定同源性的两条核酸（DNA或RNA）单链在适宜的温度及离子强度等条件下，可按碱基互补配对原则高度特意地复性成双链DNA的化学降解测序经聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影检测后可以读出待测DNA分子的碱基序列（53）DNA序列的读取是逆电泳方向进行的SANGER双脱氧链终止法读取的碱基序列是待测DNA模板的互补链，而非模板链本身DNA纯化过程中的缺点加剧DNA的丢失和损伤的可能性。SANGER中载体的存在不但不会影响测序的结果，反而有利于测序的进行，因为在实际操作中，引物往往不得与待测DNA的3端互补，而是与载体克隆位点的两侧序列互补，这样可以测定完整的DNA序列TDNADDNAOCDNALDNACCCDNADNA测序通常包括克隆、测序反应和读序三个步骤，1、DNA的分离与抽提方法；1酚氯仿抽提法使用酚的优点1有效变性蛋白质；2抑制了DNASE的降解作用。用酚氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚氯仿中加少许异戊醇，为什么1减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。2异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定2盐析法3氯化铯密度梯度离心法4固相萃取法2、DNA提取常见问题，原因分析及其对策问题一DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。原因1DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质2DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应3DNA中残留有金属离子对策1重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质（具体方法见前）2重新沉淀DNA，让酒精充分挥发3增加70乙醇洗涤的次数（23次）问题二DNA降解。原因1材料不新鲜或反复冻融2未很好抑制内源核酸酶的活性3提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断4外源核酸酶污染5反复冻融对策1尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融2液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液3在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量4细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔5所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌6将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融问题三DNA提取量少。原因1实验材料不佳或量少2破壁或裂解不充分3沉淀不完全4洗涤时DNA丢失对策1尽量选用新鲜（幼嫩）的材料2动植物要匀浆研磨充分；G菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁3高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加PK的用量）4低温沉淀，延长沉淀时间5加辅助物，促进沉淀6洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒3、P63猪肝脏总RNA的提取RNA提取常见问题，原因分析及其对策猪肝脏总RNA的提取一、准备试剂氯仿，异丙醇，75乙醇，无RNASE的水或05SDS（溶液均需用DEPC处理过的水配制）。二、操作步骤1匀浆处理将组织在液氮中磨碎，每50100MG组织加入1MLTRIZOL，用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIZOL体积10。2将匀浆样品在室温（1530）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。3可选步骤如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2810000G离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。5每使用1MLTRIZOL加入02ML氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。62810000G离心15分钟。样品分为三层底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIZOL试剂的60。7把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1MLTRIZOL加入05ML异丙醇，室温放置10分钟。82810000G离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。9用75乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1MLTRIZOL至少加1ML75乙醇。28不超过7500G离心5分钟，弃上清。10室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾510分钟即可不要真空离心干燥，过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低。加入25200L无RNASE的水或05SDS，用枪头吸打几次，5560放置10分钟使RNA溶解如RNA用于酶切反应，勿使用SDS溶液。RNA也可用100的去离子甲酰胺溶解，70保存。问题一RNA的降解（1）新鲜细胞或组织的RNA降解RNA降解1裂解液的质量2外源RNASE的污染3裂解液的用量不足；4组织裂解不充分5另外某些富含内源酶的样品如脾脏，胸腺等，很难避免RNA的降解。建议在液氮条件下将组织碾碎，并且匀浆时使用更多裂解液。（2）冷冻样品的RNA降解1样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后可以移至70冰箱保存。样品要相对小一点；2先用液氮研磨，再加裂解液匀浆；3样品与裂解液充分接触前避免融化，研磨用具必须预冷，碾磨过程中及时补充液氮。问题二OD260/OD280比值偏低（1）蛋白质污染；（2）苯酚残留；（3）抽提试剂残留；（4）设备限制。问题三电泳带型异常（1）非变性电泳上样量超过3UG，电压超过6V/CM，电泳缓冲液陈旧，均可能导致28S和18S条带分不开。（2）变性电泳条带变淡EB与单链的结合能力要差一些，故同样的上样量，变性电泳比非变性电泳要淡一些；（3）甲醛的质量不高问题四下游实验效果不佳（1）RNA降解；（2）抽提试剂的残留；（3）样品中杂质的残留；（4）DNA污染。4、已知单链RNA的序列，分别用SANGER和化学裂解法测定其序列，写出操作过程。SANGER双脱氧链终止法原理DNA复制是以一条链为模板，按碱基配对原则复制新合成的链复制可以在体外进行2和3双脱氧的DDNTP会使复制终止（双脱氧链终止）DNA聚合酶能够利用单链DNA作模板，合成出对应的DNA互补链，但在反应过程中，如果2，3双脱氧链核苷酸三磷酸底物掺入到寡核苷酸链的3端，DNA链的延伸反应即被终止。在4个反应体系中分别加入一种DDNTP反应底物（DDCTP、DDATP、DDGTP、DDTTP）以及DNA模板、合成引物、DNA聚合酶、一定浓度是DNTP（DCTP、DATP、DGTP、DTTP，其中有一种是带32P放射性标记的），使DNA链的合成随机终止于某一特定DDNTP。最后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影技术读出待测DNA模板的碱基序列。步骤1分离待测核酸模板2在4只试管中加入适当的引物、模板、4种DNTP包括放射性标记DATP，例如32PDATP和DNA聚合酶（如以RNA为模板，则用反转录酶），再在上述4只管中分别加入一种一定浓度的DDNTP双脱氧核苷酸。3与单链模板（如以双链作模板，要作变性处理结合的引物，在DNA聚合酶作用下从5端向3端进行延伸反应，32P随着引物延长掺入到新合成链中。当DDNTP掺入时，由于它在3位置没有羟基，故不与下一个DNTP结合，从而使链延伸终止。DDNTP在不同位置掺入，因而产生一系列不同长度的新的DNA链。4用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳同时分离4只反应管中的反应产物，由于每一反应管中只加一种DDNTP如DDATP，则该管中各种长度的DNA都终止于该种碱基如A处。所以凝胶电泳中该泳道不同带的DNA3末端都为同一种双脱氧碱基。5放射自显影。根据四泳道的编号和每个泳道中DNA带的位置直接从自显影图谱上读出与模板链互补的新链序列。SANGER双脱氧链终止法的技术要点制备单链DNA模板，即待测序的DNA链制备一小段模板链特殊的DNA多聚酶制备2和3双脱氧的DDNTP化学降解法测序（1）待测模版DNA分子的制备一般用限制性内切核酸酶将待测DNA分子切割成250300BP的片段，然后用碱性磷酸酶除去DNA片段5端的磷酸根，最后用T4多核苷酸激酶和R32PATP，使DNA片段的5端带上放射性核酸标记。（2）化学降解待测模版的DNA分子纯化并碱变性待测DNA片段，回收其中的一条单链，分装在4支试管中进行上述4组特异性切割反应。4组反应分别产生大小不同且具有共同标记末端的寡核苷酸片段混合物。（3）待测模版DNA分子的序列分析通过聚丙烯酰胶凝胶电泳将上述4组反应的寡核苷酸片段进行分离，经放射自显影后即可从X光片上读出DNA序列。5、P87实验设计DNA片段之间的连接答如平末端的连接直接用T4DNA连接酶先用末端脱氧核苷酸转移酶给平末端DNA分子加上POLYDAPOLYT尾巴后，再用DNA连接用衔接物连接平末端DNA分子DNA接头连接法DNA序列测定法DNA的化学降解测序法1、不对称粘性末端两种限制酶消化后，需纯化载体以提高连接效率；载体与外源DNA连接处的限制酶切位点常可保留；非重组克隆的背景较低；外源DNA可以定向插入到载体中。2、对称性粘性末端；线形载体DNA常需磷酸酶脱磷处理；载体与外源DNA连接处的限制酶切位点常可保留；重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝；外源DNA会以两个方向插入到载体中。6、在进行DNA重组研究时，如何防止DNA酶的污染。1所有的玻璃器皿均应在使用前于180的高温下干烤6HR或更长时间。2塑料器皿可用01DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）3有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3H2O2室温10MIN，然后用01DEPC水冲洗，晾干。4配制的溶液应尽可能的用01DEPC，在37处理12HR以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经022M滤膜过滤除菌。5操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。6设置专用实验室，所有器械等应为专用。7、核酸纯度与浓度分析纯度纯净核酸OD260/OD2801720OD260/OD23020有蛋白质或酚污染OD260/OD28017有RNA污染或DNA降解OD260/OD28020或OD260/OD23020浓度若OD2601时，DSDNA浓度约为50G/ML则质粒DNA浓度G/L稀释倍数OD26050第二章基因工程工具酶大肠杆菌可具有4种表型RKMK野生型，具有完整的限制和修饰功能RKMK限制缺陷型，不能降解外源DNA，但具有修饰功能这类突变株常用于转化实验RKMK限制和修饰缺陷型，既无限制功能又无修饰功能，常用于转化实验RKMK修饰缺陷型，缺乏修饰自身DNA的功能限制性核酸内切酶的特点识别DNA分子中48个碱基的特定序列呈旋转对称,回文结构切割位点用或/表示识别序列在内部、两侧限制性核酸内切酶是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二脂键断开的内脱氧核苷酸酶目前发现有限制性核酸内切酶的生物主要是细菌、少数霉菌和蓝藻限制性核酸内切酶可分为型、型、型酶限制性核酸内切酶在双链DNA上能够识别的特殊核苷酸序列被称为识别序列。同裂酶来源不同，具有相同的识别序列。同裂酶可以具有不同的或相同的切割位点同尾酶识别序列不同，切割DNA分子所得的DNA片段具有相同的黏性末端对称地分布在识别序列中心位置两侧，这样切割的结果产生的DNA片段称为黏性末端。DNA片段末端的3端比5端长称为3粘性末端，DNA片段末端的3端比5端短称为5粘性末端。两条多聚核苷酸链上磷酸二脂键断开的位置处在识别序列的对称结构中心，这样切割的结果产生的DNA片段是平齐的称为平末端DNA分子片段化方法单酶切DNA样品是环状，完全酶切后产生于识别序列数（N）相同的DNA片段数，并且DNA片段的两末端相同双酶切环状DNA分子完全酶切的结果，产生的DNA片段数是两种限制性核酸内切酶序列数之和；线性DNA分子，产生的DNA片段数是两种限制性核酸内切酶序列数之和1。先较低盐浓度缓冲液的酶进行切割后较高盐浓度缓冲液的酶进行切割；先用最适反应温度较低的酶进行酶切后用较高最适反应温度的酶进行酶切部分酶切选用的限制性核酸内切酶对其在DNA分子上的全部识别序列进行不完全的切割。原因有底物DNA的初读低、识别序列的甲基化、酶用量的不足以及反应缓冲液和温度不适宜等。大肠杆菌DNA连接酶催化双链DNA片段互补黏性末端之间连接T4DNA连接酶不仅可以催化双链DNA片段互补黏性末端之间连接，还可以催化双链DNA片段平末端之间连接。大肠杆菌DNA连接酶反应系统中辅助因子NAD；T4DNA连接酶反应系统中辅助因子ATPT4DNA连接酶作用修复双链DNA的单连缺口连接DNADNA杂交双链上的DNA链缺口或RNA链缺口，后者反应速度慢连接完全断开的两个平头双链DNA分子，属分子间连接，但速度慢，在高浓度的底物和酶的作用下方可进行DNA连接酶的特点能催化外源DNA和载体分子之间连接形成重组DNA分子。DNA片段连接前后识别序列的变化碱性磷酸酶的作用去除5磷酸基团，防止自身连接环化，把5P5OH影响DNA连接酶作用的影响反应温度、T4DNA连接酶的用量、提高外源片段与载体的浓度比值（1020倍）DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶53聚合酶活性35外切酶活性53外切酶活性,其中53聚合酶活性和53外切酶活性有修复功能,制作探针大肠杆菌DNA聚合酶大片段KLENOWDNA聚合酶枯草芽孢杆菌蛋白酶裂解得到,该酶失去了全酶53外切酶活性,具有53聚合酶活性35外切酶活性耐高温DNA聚合酶,主要用于多聚酶链式反应PCR反转录酶即依赖于RNA的DNA聚合酶,53聚合酶活性CDNA合成方向53RNASEH的活性35RNA外切酶活性53RNA外切酶活性不同组织、不同发育阶段的CDNA文库是有所差异的（）一般而言，没有原核生物CDNA文库，CDNA文库构建检测MRNA完整性1、回文结构知识点短的回文结构可能是一种特别的信号，如限制性内切酶II的识别位点（旋转对称）。较长的回文结构容易转化成发夹结构。回文结构（基数核苷酸）（切下来都是黏性末端。2、星号活性P46某些条件下，一种特异性识别顺序的限制性内切酶在酶切同一种DNA片段时会产生新的酶切位点而得到不同的酶解片段的酶活性则称星号活性。导致STAR活性产生原因1高甘油含量2限制性内切核酸酶用量过高3低离子强度4高PH5含有有机溶剂6有非MG2的二价阳离子存在3、提高平末端DNA片段连接效率的方法DNA片段末端同聚物加尾后进行连接粘性末端修饰成平末端后进行连接DNA片段5端脱磷酸化作用后连接DNA片段加连杆或衔接头后连接4、大肠杆菌DNA聚合酶I具有53DNA聚合酶活性、53外切核酸酶活性、35外切核酸酶活性5、逆转录酶具有RNA指导的DNA聚合酶活性、RNASEH活性、DNA指导的DNA聚合酶活性。商品化逆转录酶（AMVAMV反转录酶（鸟类骨髓细胞性白血病病毒）MMLV反转录酶（MOLONEY鼠白血病病毒）6、P95为了从生物材料中高效提取RNA，如何控制RNA酶活性，消除RNA酶的降解活性（一）消除生物材料内源性RNA酶的干扰。主要是在组织细胞裂解液中介入RNA酶抑制剂和变性剂，如异硫氰酸胍、盐酸胍、尿素。由于RNA酶活性的最适PH接近中性，因此组织细胞裂解液的PH偏碱性或偏酸性可部分抑制RNA酶的活性。（二）消除制备RNA过程中外源性RNA酶的干扰，可采取以下措施对于制备RNA所用的试剂，一般应该用01DEPG处理过的水配制，在37处理12小时以上，然后高压灭菌并除去残留的DEPG。对于玻璃器皿用180干烤3小时以上；对于塑料器皿，用氯仿充分冲洗。制备RNA的过程在超净工作台中进行。在制备RNA时操作者应戴口罩和一次性手套，且勤换手套。7、P66限制性内切核酸酶的作用机制限制性内切核酸酶以环状和线性的双链DNA为底物，在合适的反应条件下，识别特定的核苷酸序列，使两条核糖链上特定位置的磷酸二酯键断裂，两裂口之间的碱基对的氢键也随之断开，产生具有3羟基和5磷酸基的DNA片段。8、DNA连接酶有哪些连接方法一、具互补粘性末端片段之间的连接二、具平末端DNA片段之间的连接三、DNA片段末端修饰后进行连接9、哪些工具酶可用于制备带标记的DNA分子（探针）大肠杆菌DNA聚合酶IKLENOW酶T4DNA聚合酶反转录酶第三章基因克隆载体知识点PSC101、909KB第一个成功用于基因克隆实验的天然质粒，低拷贝型。COLE1（大肠杆菌E1）高拷贝型拷贝数一个细胞内这种质粒的数量与染色体的数量之比质粒还提供复制起始位点和决定复制强度（拷贝数）的一些基因。拷贝数少的（只有1数个拷贝）质粒称为严紧型质粒；拷贝数多的（10个以上拷贝）质粒称为松弛型质粒。不亲和性质粒（不相容性质粒）不能在同一宿主细胞中共存的质粒。亲和性质粒能在同一宿主细胞中共存的不同质粒。质粒载体的三种共同组分复制起点、筛选标记、克隆位点（填空）一般人工构建的质粒是单复制子（是非）噬菌体在ECOLI固体、液体培养基中生长不同液体培养物由浑浊变为澄清固体37过夜培养形成一个透明的斑点（噬菌斑）原因一个噬菌斑中的上百万个噬菌体颗粒均由一个噬菌体无性繁殖所产生噬菌体的主要类型插入型（只有一个限制酶切位点可使之插入）、取代型（两个酶切位点）体外重组类型置换型、插入型2个相同的质粒载体可以在同一噬菌体中存在（）由于COSMID克隆载体不含噬菌体溶菌生长途径，溶源生长途径和DNA复制系统，所以不会产生子代噬菌体，不能通过溶菌周期（是非）外源片断克隆在COSMID载体中是以大肠杆菌的形式表现出来，而不是噬菌斑（与质粒不同）（是非）1、克隆载体功能1运送外源基因高效转入受体细胞2为外源基因提供复制功能或整合能力3为外源基因的扩增或表达提供条件。具备条件1具有针对受体细胞的亲缘性和亲和性2具有与特定受体细胞相适应的复制位点3具有较高的外源DNA装载能力4具有多种单一的限制性内切酶识别、切割位点5具有合适的帅选标记一般特性1对受体细胞的可转移性2自主复制功能3显著的帅选标记4特定的多克隆位点5安全性3、蓝白斑筛选原理（重点）重组质粒转化宿主细胞后还需对转化菌进行筛选鉴定。利用互补现象进行筛选是最常用的一种鉴定方法。现在使用的许多载体都具有一段大肠杆菌半乳糖苷酶的启动子及其编码肽链的DNA序列，此称LACZ基因。LACZ基因编码的肽链是半乳糖苷酶的氨基端的短片段（146个氨基酸）。宿主和质粒编码的片段各自都不具有酶活性，但它们可以通过片段互补的机制形成具有功能活性的半乳糖苷酶分子。LACZ基因编码肽链与失去正常氨基端半乳糖苷酶的突变体互补，这种现象称为互补。由互补而形成的有功能活性的半乳糖苷酶，可以用XGAL（5溴4氯3吲哚D半乳糖苷）显色测定出来，它能将无色化合物XGAL切割成半乳糖和深蓝色的底物5溴4靛蓝，因此，任何携带着LACZ基因的质粒载体转化了染色体基因组存在着此种半乳糖苷酶突变体的大肠杆菌细胞后，便会产生出有功能活性的半乳糖苷酶，在IPTG异丙基硫代D半乳糖苷诱导后，在含有XGAL的培养基平板上形成蓝色菌落。而当有外源DNA片段插入到位于LACZ的多克隆位点后，就会破坏肽链的阅读框，从而不能合成与受体菌内突变的半乳糖苷酶相互补的活性肽，而导致不能形成有功能活性的半乳糖苷酶，因此含有重组质粒载体的克隆往往是白色菌落。（1）XGAL（2）半乳糖苷酶（可分解XGAL、从无色变成蓝色）（3）LACZ的肽互补（4）IPTG诱导（LACZ的C端部分和肽互补基因都表达）MCS有插入蓝斑，无插入白斑全部都是白斑的原因菌落、载体本身受到污染4、质粒载体改造构建的指导思想构建质粒载体一般原则删除不必要的DNA区域,提高外源基因的装载量灭活某些质粒的编码基因及对质量复制产生负调控效应的基因提高拷贝数加入易于识别的选择标记基因,检测含有重组质粒的受体细胞。在选择标记基因内引入具有多克隆街头,删除重复的酶切位点,使其单一化根据外源基因克隆的不同要求,分别加装特殊的基因表达调控元件5、常用的质粒载体类型（1）克隆质粒载体（2）质粒载体（大肠杆菌表达型质粒载体、融合型蛋白表达载体PGEX3X、非融合型蛋白表达载体PKK2233、穿梭质粒载体）穿梭质粒载体是一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记，因而可以再两种不同的宿主细胞中存活和复制是质粒载体（是非）6、噬菌体的克隆步骤（1）通过裂解过程增殖载体（DNA感染ECOLI提取）由浑浊斑变成澄清（液体培养基）（2）载体与外源DNA的酶切（3）外源DNA与载体的连接（4）重组噬菌体的体外包装（5）包装噬菌体颗粒的感染（6）筛选噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体包转序列，复制子以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体7、野生型噬菌体的局限性1结构DNA基因组大而且复杂，具有许多基因克隆常用的限制性酶识别（2）噬菌体外壳只能接纳一定长度的DNA分子。8、噬菌体的构建基本策略（1）缩短野生型的DNA长度，提高外源DNA的有效装载量，根据切除的多少可将DNA分成两大类载体插入型载体（一个限制酶切位点），取代型载体（2个限制酶切位点）（2）删除重复是酶切位点，引入单一的多酶切位点街头序列，增加外源DNA克隆的可操作性（3）灭活某些与裂解周期有关基因，使DNA载体只能在特殊的实验条件下感染裂解宿主细菌，以避免可能出现的生物污染现象的发生（4）引入合适的选择标记基因，便于重组噬菌体的检测（5）建立重组DNA分子体外包装系统9、COSMID克隆载体（黏性载体/克斯质粒载体）是一类由人工构建的含有DNA的COS序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体（1）COSMID克隆载体结合了质粒克隆载体和噬菌体克隆载体的优点，克隆能力3145KB（2）COSMID克隆载体三部分质粒复制起点、抗性标记、COS位点（3）COSMID克隆载体的特征具有噬菌体的特性具有质粒载体的特性具有高装载能力10、表达载体构建的一般原则1阅读框架与外源基因高效表达2启动子与外源基因高效表达（1）外源基因在宿主细胞中的有效表达是基因工程的核心问题（2）外源基因的起始转录是基因表达的关键步骤（3）转录起始的速率是基因表带的限速步骤诱导型表达载体是指启动子必须在特殊的诱导条件下才有转录活性或比较高的转录活性的表达载体3转录的有效延伸和终止与外源基因的高效表达（1）除去衰减子（2）插入抗终止的序列（3）强转录终止序列4有效的翻译起始与外源基因高效表达5终止密码选择与外源基因高效表达6外源蛋白的稳定性与外源基因高效表达载体原核生物基因克隆载体（细菌质粒载体、噬菌体克隆载体、COSMID克隆载体、M13噬菌体载体）、酵母基因克隆载体、植物基因克隆载体、人工染色体载体11、四种常用载体的比较（细菌质粒载体、噬菌体克隆载体、COSMID克隆载体、M13噬菌体载体）第四章目的基因的分离与修饰目的基因的基本分离制备法P169直接分离法、基因文库分离法、PCR扩增法、差示分析法、DNA插入诱变法、基因定位克隆、标签测序法、化学合成法。1、目的基因的制备直接分离法1限制性核酸内切酶酶切分离法单酶切、双酶切、部分酶切2基因分离的物理化学法密度梯度离心法、单链酶解法、分子杂交法3双抗体免疫分离编码蛋白的基因4利用酶促反转录法直接从特定MRNA分离基因2、基因组文库与CDNA文库的主要区别（重点）基因组文库克隆的任何基因；CDNA文库克隆的具有蛋白质产物的结构基因，基因组文库中的编码的是真实基因，CDNA克隆的是不含内含子的基因。基因组文库克隆的全部遗传信息，不受时空限制；CDNA文库克隆的是不完全编码的DNA序列，受发育和调控因子的影响即受时空限制。从基因组文库中分离得到的基因片段很难直接用于体外的表达研究。但是它们对真核细胞基因结构的分析、基因表达和调控的研究有着重要作用。CDNA文库中筛选分离的目的基因可直接用于表达，CDNA基因文库不能直接用于基因组DNA中的非转录区段的序列研究以及基因编码区外侧控序列的结构基因结构、组织和表达的强有力手段。3、建库步骤基因组DNADNA插入片段重组DNA转化宿主文库扩增、保存筛选MRNACDNA载体DNA4、噬菌体CDNA文库的构建总RNA的分离总RNA的纯化CDNA第一链的合成第二链的合成（方法P181）甲基化加衔接头载体连接噬菌体的包装导入噬菌斑原位杂交利用聚合酶链式反应（PCR）技术扩增目的基因原理利用聚合酶链式反应（PCR）技术，在体外特异性扩增某个基因模板DNA变性引物与DNA模板复性DNA延伸PCR过程反应系统加热至9095，底物双链DNA变性称为两条单链DNA，作为互补链聚合反应的模板；降温至3760，使两种引物分别与模板DNA链的3一侧的互补序列杂交（复性）；升温至7075，耐热性DNA聚合酶催化引物按53方向延伸，合成模板DNA链的互补链。在退火下1MIN，引物优先与DNA模板复性。PCR特点特异性高敏感性高需要的模板量极低，理论上一条模板链快速23H简便对模板纯度要求低，不需要纯化甚至可直接用细菌可扩展MRNA）（反转录）影响PCR的因素TAPDNA聚合酶、其他耐热DNA聚合酶、引物、模板、DNTP、MG离子浓度引物是人工合成的单链DNA小片段，碱基顺序分别与所要扩增的DNA双链的5端相同，3端序列互补。引物的3端决定引物的特异性，3端与模板DNA一定要配对；引物的5端决定了PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大，因此5端碱基并没有严格的限制。在PCR扩增中，对于引物来说，只要其3端的序列有足够长度来启动延伸，而5端含有不匹配的序列，并不影响正常的扩增。引物5端修饰加酶切位点，引入突变位点，插入与缺失突变序列引入启动子序列PCR产物积累规律示意图（笔记）PCR的相关技术反转录PCR（RTPCR）是将MRNA反转录与PCR技术相偶联的一种基因分离技术已知DNA序列的PCR扩增（各种方法概念比较）（1）套式PCR是指用两对引物扩增同一样品的方法。（2）多重PCR是指利用多对引物同时扩增模板上的多个靶序列，以确定待检测的基因片段存在与否及其数量。（3）不对称PCR两个引物能浓度比不同已知CDNA一端序列获得全长CDNA的PCR扩增（1）DNA末端的快速扩增（RACE）指以MRNA为模板，反转录合成CDNA的第一条链，然后用PCR技术扩增出从某个特点位点到3端或到5端之间的未知核苷酸序列。（2）锚定PCR（单侧PCR）是指通过添加锚定引物街头的方式来扩增合成未知序列或未全知序列的方法。已知侧翼序列的PCR扩增（1）反向PCR扩增利用两个靶序列引物对未知片段进行常规PCR扩增（2）锅柄PCR未知序列的PCR扩增（1）MRNA差别显示技术或称差别显示反转录PCR（2）代表性差异分析（3）抑制性消减杂交定量PCR差式PCR通过PCR扩增来定量扩增体系中的DNA或RNA的起始拷贝数量免疫PCR是一种具有非常高灵敏度的抗原检测系统，它将抗原检测系统与PCR偶联起来，通常的做法是将一段已知序列的DNA片段标记到抗原抗体复合物上，在用PCR方法将这段DNA扩增，最后用常规免疫学方法检测PCR产物。5、获得目的基因方法的选择（1）根据获得目的基因的研究目的选择方法研究基因全长结构调控DNA信息分析构建基因组文库开展目的基因重组表达制药、治疗构建CDNA文库若目的基因序列明确，可设计引物通过PCR/RTPCR克隆若目的基因序列短小，可化学合成（2）根据目的基因本身特点选择方法对从基因组中克隆的基因（内含子）只能真核表达对从CDNA中克隆的基因（无内含子）可在真核和原核表达要选择MRNA表达丰富的组织材料,PCR克隆的基因测序（3）根据实验室设备条件选择方法基因组文库不一定自行构建目的基因序列明确，无需建库，可直接由PCR/RTPCR克隆基于氨基酸或全蛋白序列的基因克隆全蛋白序列氨基酸序列首尾两个核苷酸序列抗体核苷酸序列一对合成引物合成寡核苷酸筛选表达文库筛选DNA基因组文库PCR扩增目的基因6、如果已知某基因的一段DNA序列，如何获得该基因利用染色体歩移的方法以获得与已知序列相邻的未知序列，从而获得该基因7、如果已知某基因的两段DNA序列，如何获得该基因直接设计引物然后用延伸性好一点的酶直接PCR8、已知蛋白质的部分氨基酸序列，怎样克隆编码该蛋白质的基因在蛋白数据库搜索同源蛋白,然后对应搜出的基因，设计引物PCR作出全长9、已分离纯化某蛋白质并制备了相应的抗体，如何克隆其编码基因用抗体纯化出正在翻译的蛋白质，得到其RNA，然后逆转录得到其DNA后设计引物然后进行PCR10、如果已获得某基因的DNA序列，如何研究其结构功能第五章重组基因导入受体细胞1、以原核生物细胞表达真核生物基因存在的缺陷（必考）P2091有为数不少的真核生物基因不能在原核生物中表达出具有生物活性的功能蛋白，其原因是原核生物细胞不具备真核生物的蛋白质折叠复性系统，即使真核生物基因能得到表达，得到的多是无特异性空间结构的多肽链。2原核生物细胞缺乏真核生物的蛋白质加工系统，而许多真核生物蛋白质的生物活性正是依赖于其侧链的糖基化或磷酸化等修饰作用。3原核细胞内源性蛋白酶易降解异源蛋白，造成表达产物不稳定。至今被用作受体菌的原核生物有大肠杆菌、枯草杆菌、蓝细菌等。2、受体细胞选择原则（了解特别是缺陷型P237）（1）便于重组DNA分子导入（2）能使重组DNA分子稳定存在于细胞中（3）便于重组体的筛选；（4）遗传稳定性高，易于扩大培养或发酵生长（5）安全性高无致病性，不会对外界环境造成生物污染（6）选用内源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低的细胞（7）受体细胞在遗传密码的应用上无明显偏移性（8）具有较好的转译后加工机制，便于真核目地基因的高效表达（9）在理论研究和生产实践上有较高的应用价值3、重组体的转化重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细内稳定维持和表达的过程称之为转化受体菌染色体组进行复制，杂合区段亦随之进行半保留复制，当细胞分裂后，该染色体发生分离，形成一个新的转化子ECOLI的钙转化（钙离子诱导大肠杆菌转化法）（1）制备受体细胞感受态细胞是指处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态的细胞菌种分纯活化，扩大培养沉淀菌种（45000G离心5MIN）在含CACL2的无菌预冷缓冲液中冰水浴15MIN44000G离心5MIN弃上清液沉淀物悬浮于含CACL2的无菌预冷缓冲液中4下放置1214H（2）DNA分子转化感受态细胞02ML感受态细胞加入NET缓冲液溶解的01MLDNA轻摇几次42水浴2MIN37水浴中温育5MIN加1ML不含选择药物的LB培养基37振荡培养3060MIN涂平板培养筛选转化子（3）转化处理过程中，可能感染杂菌，导致假阳性转化子的出现，因此转化处理过程中须设以下几种对照处理（1）DNA对照处理02ML蒸馏水代替02ML感受态细胞，检验DNA溶液是否染菌（2）感受态细胞对照处理01MLNET缓冲液代替01MLDNA溶液，检测感受态细胞是否染菌（3）感受态细胞有效性对照处理02ML感受态细胞中加入01ML已知容易转化这种感受态细胞的质粒DNAECOLI的电穿孔转化转化率是指DNA分子转化受体菌获得转化子的效率，有两种表示方法（1）转化子数/用于转化处理的DNA分子数或质量（2）转化子数/用于转化处理的手提细胞数转染将重组噬菌体DNA分子直接导入受体细胞的过程转导是指通过噬菌体（病毒）颗粒感染宿主细胞的途径把外源DNA分子转移到受体细胞内的过程体外包装是指在体外模拟噬菌体DNA分子在受体细胞内发生的一系列特殊的包装反应过程，将重组噬菌体DNA分子包装为成熟的具有感染能力的噬菌体颗粒的技术重组DNA分子导入植物细胞农杆菌介导的TI质粒载体转化法重组DNA分子导入哺乳动物细胞病毒颗粒转导法4、重组DNA分子转入真核生物细胞方法磷酸钙转染技术、电穿孔法、基因枪法、激光微束穿孔法、脂质体介导、病毒颗粒转导法、多聚物介导法5、重组DNA操作一般步骤（1）分离提取和获得目的基因和载体DNA；（2）切割分别对目的基因和载体DNA酶切；（3）连接目的基因与载体连接，形成新的重组DNA分子；（4）转化用重组DNA分子转化受体细胞；（5）筛选能在受体细胞中复制和遗传；对转化子筛选和鉴定；（6）表达对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。6、遗传表型直接筛选法1根据载体选择标记初步筛选一般的做法是将转化处理后的菌液（包括对照处理）适量涂布在选择培养基上，在最适生长温度条件下培养一定时间，观察菌落生长情况，即可挑出转化子（1）抗药性筛选P287抗菌素等作为选择药物，几种常用的抗药性选择标记产物类型，如AP、CM、KN、TC等，两种遗传表型的表示方法。观察和确定转化子菌落的培养世纪不宜过长，以1216H为宜，否则会出现假转化子菌落。这是因为转化子菌落会降解选择药物，导致菌落周围选择药物浓度降低，从而长出非抗菌素的菌落。实验组和对照组该不该长菌及其原因（2）插入失活筛选法P288为什么要用双重标记插入失活的具体做法。（3）插入表达筛选法P288例如PTR262质粒载体。（4）显色互补筛选法P290XGAL麦康凯培养基蓝白斑筛选；假若是麦康锴培养基，就不是蓝白斑，但筛选原理是一样的。由于被转化的基因产物作用于XGAL需要较长的时间，因此观察和确定转化子菌落是培养时间可适当延长。但必须严格挑单菌落作为转化子供进一步实验（5）利用报告基因筛选植物转化细胞P291（6）利用遗传选择标记筛选哺乳动物转基因细胞P2932营养缺陷型检测法P295转化进来的外源基因产物弥补受体菌的突变型缺陷，使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。如何利用选择性培养基进行筛选3形成噬菌斑筛选法免疫标记蓝白斑标记P295将外源基因克隆到LACZ区段的插入型噬菌体上后，如何进行筛选重组噬菌体当外源DNA片段插入LACZ基因内时，重组噬菌斑无色透明，而非重组子噬菌斑则成蓝色依赖于重组子结构特征分析的筛选法P2961快速裂解菌落鉴定分子大小利用琼脂糖凝胶电泳时迁移速率的快慢鉴定重组子和非重组子。2限制性核酸内切酶酶解分析法利用重组质粒电泳条带多一条鉴定重组子和非重组子；并根据酶切图谱分析其插入方向。3利用PCR方法筛选确定重组子提取质粒DNA进行PCR，再对其产物进行电泳确定是否是重组子菌落。7、核酸分子杂交检测法核酸分子杂交检测法实际上是一种依赖于重组子结构特征进行的重组子筛选方法四类核酸分子杂交是技术路线SOUTHERN印记杂交NORTHERN印记杂交斑点印记杂交菌落原位杂提取DNA提取RNA提取DNA或RNA按菌落或噬菌斑印迹到膜上琼脂糖凝胶电泳变性核酸将核酸转移到膜上核酸点到膜上变性DNA核酸固定到膜上预杂交（清除非特异性吸附位点）加入标记的探针杂交漂洗膜（洗去非特异性结合的探针）放射自显影或显色反应示踪SOUTHERN与NORTHERN的比较SOUTHERN印记杂交NORTHERN印记杂交靶核苷酸DNARNA变性DNA电泳前和电泳中不变性RNA电泳前加热变性，电泳时加变性剂保持RNA处于变性状态转膜转膜前需用碱对其进行变性转膜前不需要进行变性和中和处理ELISA（酶联免疫吸附测定）的一般步骤（填空或选择）固定样品、一抗结合、二抗结合、显色反应、比色探针的概念及其三种制备方法切口平移标记法、随机引物标记法（标记模板的互补链P311）、末端标记法作为理性条件的探针需具备什么条件（1）标记物不会影响探针的主要理化性质（2）检测灵敏度高、特异性强、本底低、重复性好（3）操作简便、省时，经济实用（4）化学稳定性高、易于长期保存（5）安全、无环境污染8、免疫化学检测法利用抗体作为“探针”来检测转入受体菌，并且表达出相应的蛋白质的外源基因，即蛋白质蛋白质“杂交”。有抗体检测法和免疫沉淀检测法。9、免疫化学杂交（概念）41抗体检测法一抗、二抗和产物的结合进行检测42酶联免疫吸附测定（ELISA）（非放射性抗体测定法）概念及其检测的一般步骤。固定样品、一抗结合（决定限制性，此法的准确性）、二抗结合、显色反应、比色43免疫沉淀检测法44免疫印记法关键是蛋白质电泳。5、基因表达产物分析对于转录产物，用NORTHERN印记杂交技术进行检测分析。免疫化学检测基因产物免疫沉淀检测法、酶联免疫吸附测定（ELISA）、WESTERN印记杂交、固相放射免疫法。10、如何选择合适的转化外植体（1）选择优良的种质及母株无论是离体培养繁殖种苗，还是进行生物技术研究，培养材料的选择都要从主要的植物入手，选取性状优良的种质、特殊的基因型和生长健壮的无病虫害植株。尤其是进行离体快繁，只有选取优良的种质和基因型，离体快繁出来的种苗才有意义，才能转化成商品；生长健壮无病虫害的植株及器官或组织代谢旺盛，再生能力强，培养后容易成功。（2）选择适当的时期组织培养选择材料时，要注意植物的生长季节和生长发育阶段，对大多数植物而言，应在其开始生长或生长旺季采样，此时材料内源激素含量高，容易分化，不仅成活率高，而且生长速度快，增殖率高。若在生长末期或已进入休眠期时采样，则外植体可能对诱导反应迟钝或无反应。花药培养应在花粉发育到单核靠边期取材，这时比较容易形成愈伤组织。百合在春夏季采集的鳞茎、片，在不加生长素的培养基中，可自由地生长、分化；而其他季节则不能。叶子花的腋芽培养，如果在1月至翌年2月间采集，则腋芽萌发非常迟缓；而在38月间采集，萌发的数目多，萌发速度快。（3）选取适宜的大小培养材料的大小根据植物种类、器官和目的来确定。通常情况下，快速繁殖时叶片、花瓣等面积为5MM2，其他培养材料的大小为0510CM。如果是胚胎培养或脱毒培养的材料，则应更小。材料太大，不易彻底消毒，污染率高；材料太小，多形成愈伤组织，甚至难以成活。（4）外植体来源要丰富为了建立一个高效而稳定的植物组织离体培养体系，往往需要反复实验，并要求实验结果具有可重复性。因此，就需要外植体材料丰富并容易获得。（5）外植体要易于消毒在选择外植体时，应尽量选择带杂菌少的器官或组织，降低初代培养时的污染率。一般地上组织比地下组织消毒容易，一年生组织比多年生组织消毒容易，幼嫩组织比老龄和受伤组织消毒容易11、四种核酸探针杂交分析的比较基因组DNA探针、CDNA探针、RNA探针和人工合成的寡核苷酸探针DNA探针多为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列。优点第一，这类探针多克隆在质粒中，可以无限繁殖，取之不尽，制备方法简便。第二，DNA探针不易降解（相对RNA而言）。第三，DNA探针的标记方法较成熟，有多种方法，如缺口平移，随机引物法，PCR标记法等，能用于同位素和非同位素标记。CDNA探针序列中无内含子，可用于分析内源基因缺陷、外源基因和基因表达的检测。RNA探针是单链分子，所以它与靶序列的杂交反应效率极高，RNA探针虽具有DNA探针所不能比拟的高杂交效率，但它也存在易于降解和标记方法复杂等缺点。RNA探针主要应用于细菌分类（RRNA探针）和检测MRNA的表达水平（CRNA,COMPLEMENTARYMRNA）。寡核苷酸探针应用于点突变检测。只要知道点突变的确切位置，即可人工合成对应于该位置的正常和突变的一对寡核苷酸（约20个碱基左右），经末端标记后作为探针应用于杂交过程。寡核苷酸探针筛选原则第一，长度在1840NT（NUCLEOTIDE），探针过短其特异性差，过长其合成产量低；第二，GG含量为4060，超出此范围会增加非特异杂交；第三，探针分子内不应存在互补区，否则会出现抑制探针杂交的“发夹”状结构；第四，避免单一碱基的重复出现（不能多于4个），如CCCCC,第五，探针与非靶区域的同源性不应超过70或有连续8个或更多碱基的一致。16理想探针应满足的条件与其它靶序列不交叉杂交，自身不折叠，且与真正靶序列的杂交效率要高17抗体与产物的四种结合方式1）中和反应抗体结合抗原以便“