第10章-基因工程的操作过程.ppt

第十章基因工程的操作过程,第一节、表达载体的构建及导入,目的：,使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。,使目的基因能够表达和发挥作用。,一、表达载体的构建科学家在培育抗虫棉时，经历了多次失败，才获得成功。起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子(抗虫基因首端)，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入终止子(抗虫基因末端)，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。,（1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；,（2）通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；,（3）目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；,（4）为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子（增强基因启动子工作效率的顺式作用序列，能够在相对于启动子的任何方向和任何位置(上游或下游)上都发挥作用。）等；,（5）有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。,质粒,DNA分子,限制酶处理,切口黏性末端,切口获得目的基因,DNA连接酶,重组DNA（重组质粒）,同一种,2、过程:,一个,两个,两个,3、基因表达载体的组成：,a、目的基因,b、启动子,c、终止子,d、标记基因,e、复制原点,表达载体,终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止转录。标记基因：为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而筛选出有目的基因的受体细胞。,启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质。,载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了、三部分结构用到的工具酶：既用到切割载体，又用到将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是。启动子、终止子对于目的基因表达必不可少目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。,注意：,目的基因,启动子,终止子,限制酶,DNA连接酶,磷酸二酯键,二、将目的基因导入受体细胞,（一）转化：,（二）方法,将目的基因导入植物细胞,将目的基因导入动物细胞,将目的基因导入微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,氯化钙法（感受态细胞）,目的基因进入_内，并且在受体细胞内维持_和_的过程,受体细胞,稳定,表达,1.将目的基因导入植物细胞,农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法,（1）农杆菌转化法,农杆菌：,植物的受伤组织会产生一些糖类和酚类物质吸引根瘤农杆菌向受伤组织集中，使植物形成肿瘤。,此类物质主要在双子叶植物细胞壁中合成，通常不存在于单子叶植物中，农杆菌易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力。,（1）农杆菌转化法,Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。,原理：,转化过程:,Ti质粒目的基因,构建,表达载体,植物细胞,植物细胞染色DNA,新性状,农杆菌,基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。,（2）基因枪法,适用于单子叶植物,（3）花粉通道法,适用于被子植物,胚珠,花药,花丝,柱头,花柱,子房壁,子房,雄蕊,雌蕊,子房壁,珠被,珠心（胚囊）,胚珠,卵细胞,极核,植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。,滴加目的基因溶液,（3）花粉通道法,2.将目的基因导入动物细胞,（1）方法：显微注射法（将基因表达载体提纯，用显微仪注射到受精卵中）,思考：为什么要用受精卵而不用体细胞？,（2）操作程序:,提纯含目的基因表达载体,受精卵,显微注射,移植到子宫,新性状动物,早期胚胎培养,2.将目的基因导入动物细胞,常用法：CaCl2法（Ca2+增加细菌细胞的通透性）,常用菌：大肠杆菌,微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少,过程：,Ca2+处理大肠杆菌,感受态细胞,表达载体与感受态细胞混合,感受态细胞吸收DNA,3.将目的基因导入微生物细胞,细菌能够吸收DNA的状态,受精卵体细胞,受精卵,细胞/个体,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射技术,用Ca2+处理成感受态细胞,转化的原理与技术,Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化,Ca2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌等），1970年建立此技术，其原理是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态,Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化,大肠杆菌感受态细胞的制备：,100ml菌体培养至OD600=0.5，离心收集菌体,用10ml冰冷的20mMCaCl2溶液悬浮菌体，离心,用1ml冰冷的100mMCaCl2溶液悬浮菌体,冰浴放置12-24小时，备用,收集菌体,Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化,大肠杆菌感受态细胞的质粒转化：,取100ml感受态细胞，加入相当于50ng载体的重组,冰浴放置半小时,在42保温2分钟（热脉冲）,快速将转化细胞转移至冰浴中放置1-2分钟,DNA连接液，混匀,加入1ml新鲜培养基，于37培养1小时（扩增）,涂在合适的固体培养基平板上进行筛选,细菌原生质体的转化,革兰氏阳性细菌（如枯草杆菌、链霉菌等）接纳外源DNA的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌通常采用原生质体（细胞去壁后的形态）转化的方法转移质粒或重组DNA分子,酵母菌、霉菌、植物细胞也可用原生质体法进行转化,电穿孔转化,将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场。在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受体细胞均有效，但转化效率差别很大同样的原理，电穿孔法也可用于质粒消除实验,转化率,转化率是衡量转化效率的重要指标，其定义为：每微克载体DNA在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。由于在一般的转化实验规模下，每个受体细胞最多只能接受一个载体分子，因此转化率的定义也可以表征为：每微克载体DNA转化后，受体细胞接纳DNA的个数，即克隆数（在筛选时，未接纳载体或重组子的受体细胞不长）,第二节重组子的筛选与鉴定,（一）质粒载体转化大肠杆菌细胞的筛选,1、抗生素平板结合插入失活筛选法根据标记基因是否失活，确定是否有外源基因插入。,一、大肠杆菌重组体的筛选,插入失活筛选法的应用,两种情况：1、双抗生素抗性基因标记载体2、含一个抗生素抗性标记，一个lacZ基因的载体,1）双抗生素抗性标记的筛选方法,载体携带两个抗生素抗性基因，外源基因插入其中一个基因内导致其失活，用两种抗生素平板筛选重组子。第一步：正选择。在不进行插入失活抗性基因的相应抗生素平板上转化子可以生长，非转化子不能生长，可将转化子直接从平板上挑出来；第二步：负选择。在插入失活抗性基因的相应抗生素平板上转化子中的非重组子（未插入外源基因）可以生长，重组子（插入外源基因）不能生长，应与第一种抗生素板进行对照并在其上挑出含重组子的菌落。,如pBR322质粒含有TCr、Ampr两个抗药性基因，外源基因插入失活TCr后，会有三种不同表现的细胞:未转化的受体细胞TCsAmps含载体的转化菌落AmprTcr含重组体的阳性菌落AmprTcs,筛选具体做法,1、用转化反应液涂布含氨苄的LB平板，长出转化子Ampr；2、用无菌牙签将Ampr的转化子逐一挑在Tc平板上（或用无菌丝绒布、无菌滤纸影印），比较两块板上的菌落生长情况，从Amp板上挑选出Tc板上不长的菌落即为重组子。,注意：氨苄平板菌落密度不宜过大,2）蓝白斑筛选法,载体同时含氨苄青霉素抗性基因和lacZ基因，外源基因插在lacZ基因内，受体细胞为lacZ基因互补菌。在同时含氨苄青霉素和蓝白筛选显色剂（X-gal）的平板上筛选：未转化细胞不能生长；空载体转化菌长成蓝色菌落；重组子长成白色菌落。例：pUC质粒系列、pGEM质粒系列、M13噬菌体,lacZ基因编码-半乳糖苷酶；lacZ基因编码-半乳糖苷酶的N端序列片段，互补菌染色体上携带的缺陷基因编码C端片断，两者互补（-互补）形成有功能的全酶。,蓝白筛选菌落生长照片,X-gal,5-Bromo-4-Chloro-3-Indoly-D-Galactoside)，5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷-半乳糖苷酶显色剂：生色底物,IPTG及其作用,IPTG：即Isopropyl-D-thioagalactoside，异丙基-D-硫代半乳糖苷作用：乳糖操纵子诱导物，和载体上携带的大肠杆菌乳糖操纵子的调节基因（LacI）编码产物阻遏蛋白结合，阻止其与操纵基因结合，使操纵子控制的基因（lacZ等）得以表达。,含LacI的载体：如pUC8，需要诱导物不含LacI的载体：如pUC18/19，不需诱导物,研究中通常为何用IPTG而非乳糖作诱导物？乳糖会被宿主细胞利用而IPTG不被利用。,大肠杆菌乳糖操纵子基因组成,IPTG,2、插入表达筛选,载体的选择标记基因前连接一段负调控序列，插入失活负调控序列后，其下游的筛选标记基因才能表达。如pTR262质粒，在Tc（Tet）基因前有来自噬菌体的cI基因，可编码cI阻遏蛋白，抑制Tet表达。cI基因（Hind或Bgl位点）插入失活，Tc基因表达，受体细胞在Tc板上生长；未转化细胞及及空载体转化细胞Tc表达被抑制，在Tc平板上不生长。,（二）噬菌体DNA重组子的筛选,1、取代型载体：根据基因组的大小筛选，直接挑取噬菌斑即重组子机理：空载体太小而不被包装，不进入细胞；重组-DNA可包装成噬菌体颗粒并感染大肠杆菌产生噬菌斑；未感染菌生长成菌落。,2、插入型载体,空载体及重组载体都可包装，需要插入失活载体上的标记基因筛选。,lacZ基因插入失活筛选：蓝白筛选cI基因插入失活筛选：cI筛选,选择标记基因,1）利用lacZ基因的插入失活筛选重组噬菌斑,如含有lacZ基因的M13噬菌体及多种噬菌体载体（gt11）重组噬菌斑无色透明，非重组噬菌斑呈蓝色，未转化细胞长出菌落,原理：cI基因编码的阻遏蛋白可使感染了噬菌体的大肠杆菌进入溶原化状态；cI基因的插入失活使感染了噬菌体的大肠杆菌由溶原状态进入溶菌状态。重组噬菌斑：无色透明非重组噬菌斑：浑浊未转化菌：正常菌落,Polylinker插入不影响lacZ基因表达,单酶切时有这种情况,噬菌斑,2）cI基因插入失活筛选,例：gt10BNNl02（C600hflA）系统C600hflA是一种hflA突变菌；cI基因正常表达的噬菌体在其中溶原生长，不形成噬菌斑；但cI基因插入失活的重组噬菌体却能形成噬菌斑（YoungandDavis1983a）。,hfL：highfrequencelysogenization,二、转化/重组酵母菌的筛选,（一）营养缺陷互补基因（二）显性标记基因,（一）利用营养缺陷互补基因的筛选方法,原理：受体细胞为某种营养缺陷型突变株，即不能合成某种营养成分，在缺乏该营养成分的培养基上不能生长；携带相应营养成分合成基因的载体转化受体菌后，使细胞在选择培养基（不含某种相应营养物质的培养基）中能够生长，而未被转化的细胞不能生长。,酵母常用营养标记基因,第一类：氨基酸合成基因：组氨酸合成酶基因HIS4色氨酸合成酶基因TRP1亮氨酸合成酶基因LEU2精氨酸合成酶基因ARG4第二类：核苷酸合成基因：尿嘧啶合成酶基因（URA3）,1、含HIS的载体,分泌型表达载体主要有：pPIc9，pPIc9k，pHIL-S1，pPIcza，pYAM75P6；胞内表达的载体主要有：pHIL-D2，pA0815，pPIC3K，pPICZ，pHWO10，pGAPZ，pGAPZa等,组氨醇脱氢酶基因（his4）缺失的毕赤酵母,主要有三类：GS115、SMDI168、KM71均不能合成组氨酸载体需携带his4，转染后的阳性重组子可以用不含组氨酸的MM平板进行筛选,2、含URA3的载体,载体：酵母菌的Yep系列载体：含Amp、Tc和URA3（尿嘧啶）标记基因受体细胞：EGY48菌株,Amp、Tc抗性基因用于在大肠杆菌中筛选重组子URA3标记基因用于酵母转化细胞的筛选,（二）酵母常用显性标记基因,1、氨基糖苷类药物磷酸转移酶基因：Neo（neomycin）。2、博来霉素抗性基因：Zeo（Zeocin）。如pFLD1载体,1、Neo选择系统,Neo基因编码氨基糖苷磷酸转移酶，可以灭活氨基糖甙类抗生素，是新霉素（neomycin）、新霉素衍生物G418、卡那霉素等抗生素的抗药基因。,2、Zeo选择系统,Zeo是编码博来霉素抗性产物的基因。博来霉素（bleomycin）是一种广谱抗肿瘤药。,（三）酵母其他显性标记基因,1、蓝白筛选基因：LacZ基因2、铜离子抗性蛋白基因：CUP1基因。编码一种铜离子螯合蛋白，适合铜离子敏感菌（如酿酒酵母）的筛选。3、赭石突变抑制基因：sup4,利用赭石突变抑制基因sup4筛选重组酵母菌,酵母菌AB1380（与YAC载体配套）的胸腺嘧啶合成酶基因带有一个赭石突变ade2-1，使其在基本培养基上形成红色菌落，但在缺少某种营养素的选择培养基上不能生长。当带有赭石突变抑制基因sup4的空载体存在于细胞中时，可抑制ade2-1基因的突变效应，该酵母菌在选择培养基上形成正常的白色菌落；sup4被外源基因插入失活后重组子呈红色。,YAC载体带有trp1、leu2和his3、ura3以及sup4,密码子改变成UAA的无义突变又叫赭石突变,三、重组子的鉴定,核酸分子杂交法裂解细菌电泳鉴定分子大小限制性内切酶法PCR法基因产物检测法序列分析,（一）核酸分子杂交筛选法,1、Southern印迹杂交：用标记的核酸探针检测目的基因存在与否步骤：1、用内切酶消化重组子2、凝胶电泳分离3、印迹到硝酸纤维素膜上4、用标记的DNA探针杂交，若有带显示，说明其来源细胞为阳性重组体。,Southern印迹杂交,（1）原位杂交筛选对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落。,（2）R-环检测法DNA-RNA杂交。用外源基因的mRNA与重组载体杂交。电镜下可见一种R-环形结构。,用DNA（或RNA）探针检测RNA样品。主要检测插入片断是否被转录。,2.Northernblotting（Northern杂交）,（二）电泳筛选重组子,是从初筛的转化子中进一步筛出重组子的方法。依据：重组载体与空载体DNA大小不同，在同一电场的迁移率也不同,适用于插入片段较大的重组子筛选（重组子与载体电泳迁移率差别较明显）,电泳鉴定分子大小法筛选重组子的步骤,（三）限制性内切酶法,原理：外源片段通过特定的酶切位点插入到载体上，因此，可以用这些限制性酶切割提取的质粒DNA，电泳分析插入片段。,用途：1、区分期望重组子和非期望重组子2、判断插入的DNA分子质量3、判断平末端连接的插入方向,（四）PCR法,原理：根据插入DNA片段设计特异性引物，以小量抽提的转化子DNA为模板，进行PCR反应，能扩增出特异片段的转化子为携有目的基因的重组子。应用：1、鉴定重组子2、鉴定插入片断方向,PCR引物设计示意图,引物仅与载体上外源基因两侧序列或外源基因序列互补时，只能判断插入片段有无及大小而不能判断插入片段方向；引物与载体上外源基因两侧序列及部分外源基因序列同时互补时，既可检测插入片段有无及大小，又可检测插入方向。,（五）蛋白表达检测法,SDS-PAGEWesternBlotELISA,1、SDS-PAGE,原理：根据对表达蛋白的大小的了解，电泳后考马氏亮兰染色观察有无期望带出现应用：初步检测表达量比较高的蛋白（1mg/L）方法：制备重组细胞和非重组细胞的蛋白粗提液，聚丙烯酰胺凝胶电泳