《抗体制备课件》PPT课件

1,第十一章抗体制备,抗体的制备技术经历了三代：第一代抗体是传统的抗体制备方法即利用抗原免疫动物后获得抗体，称为多克隆抗体（polyclonalantibody）；第二代抗体是通过杂交瘤技术制备出针对抗原中某一抗原决定簇的抗体称为单克隆抗体(monoclonalantibody,McAb)；第三代抗体是利用基因工程技术制备而来，称为基因工程抗体(geneticengineeringantibody)。本章主要介绍三种类型抗体的制备方法。,2,一、免疫原制备免疫原(immunogen）是指能刺激机体免疫系统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的抗原。,3,（一）细胞性抗原的制备1.绵羊红细胞的制备2.细菌抗原的制备,4,（二）可溶性抗原的制备1.细胞破碎（1）物理法：物理破碎法主要有高速组织捣碎机处理法、玻璃匀浆器处理法、超声破碎法、反复冻融法等方法。（2）化学法：化学法主要有酶处理法、表面活性剂处理法等方法。,5,2.可溶性抗原的提取与纯化（1）超速离心分离法（2）选择性沉淀法盐析法：有机溶剂沉淀法：。高分子聚合物沉淀法：。等电点沉淀法：。（3）超滤法：,6,（4）层析法凝胶过滤法离子交换层析法亲和层析法（5）电泳法,7,3.纯化抗原的鉴定抗原鉴定：含量、分子量、纯度及免疫学活性等。蛋白含量的测定可采用双缩尿法、酚试剂法、紫外光吸收法等；分子量鉴定可用SDS-PAGE法、凝胶过滤法等；蛋白质纯度鉴定方法常用的有：醋酸纤维膜电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、毛细管电泳、等电聚焦、高效液相层析法等。免疫学活性鉴定常用免疫双向扩散法、免疫电泳法或ELISA法等。,8,（三）半抗原性免疫原的制备1.载体选择常用载体：蛋白质、多肽聚合物、大分子聚合物。（1）蛋白质类：常用的有人血清白蛋白、牛血清白蛋白、血蛋白等，其中以牛血清白蛋白最为常用。（2）多肽类聚合物：是由人工合成的多肽聚合物，也是一类良好的载体，常用的有多聚赖氨酸。（3）大分子聚合物：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、羧甲基纤维素(CMC)等皆可与半抗原结合，加入福氏完全佐剂可诱导动物产生良好的抗体。,9,2.连接方法半抗原与载体的连接有物理法和化学法。物理法是用物理吸附法将载体与半抗原连接，其原理是通过电荷和微孔来吸半抗原，吸附载体主要有PVP和CMC等；化学法是利用某些功能基团把半抗原连接到白质类或多肽类聚合物载体上。不同的半抗原应选用不同的方法进行连接。,10,根据半抗原拥有的化学基团不同，连接方法主要有以下几类：带游离氨基或羧基以及二种基团皆有的半抗原：羧基可用混合酸酐法和碳二亚胺法与载体氨基形成稳定的肽键，带氨基的半抗原则可与载体羧基缩合。带有羟基、酮基、醛基的半抗原：不能直接与载体连接，需要用化学方法如琥珀酸酐法、O-（羧甲基）羟胺法等方法将之转变为带有羧基的半抗原衍生物后才能与载体连接。带有酚基的半抗原，可用一氯醋酸钠法或重氮化的对氨基苯甲酸法，生成带有羧基的半抗原衍生物。,11,（五）免疫佐剂某些物质与抗原一起或先于抗原注入机体，可增强机体对该抗原的特异性免疫应答或改变免疫应答类型，此类物质称为免疫佐剂(immunoadjuvant)，简称佐剂。,12,佐剂的种类佐剂一般包括以下几类：无机佐剂，如氢氧化铝、明钒等；生物性佐剂，如结核分枝杆菌、卡介苗、小棒状杆菌、百日咳杆菌、革兰阴性杆菌内毒素、霍乱毒素的B亚单位、胞壁酰二肽和细胞因子等；人工合成佐剂，如双链多聚肌苷酸：胞苷酸（polyI：C）、双链多聚腺苷酸：尿苷酸（polyA：U）；油剂，如弗氏完全佐剂、花生油乳剂等；纳米佐剂。,13,弗氏佐剂（Freundsadjuvant）,分为弗氏不完全佐剂和完全佐剂两种：前者是由油剂（矿物油或花生油）和乳化剂（羊毛脂或吐温-80）按1：11：5比例混合而成；后者由弗氏不完全佐剂加卡介苗组成。在免疫动物时，先将弗氏佐剂与抗原等比混匀，制成“油包水”乳化液。,14,佐剂与抗原混合乳化的方法：研磨法和搅拌混合法两种,15,2.佐剂的免疫生物学作用增强抗原免疫原性：使无或微弱免疫原性的物质变成持久或强的免疫原；增强机体对抗原刺激的反应性，提高初次应答和再次应答所产生的抗体滴度；改变抗体类型，使产生抗体由IgMG型转变为IgG型；引起或增强迟发性超敏反应。,16,3.佐剂的作用机制佐剂的作用机制归纳起来主要有如下几种：可增强抗原的表面积和改变抗原活性基团构型，从而增强抗原的免疫原性；佐剂与抗原混合一起注入机体，可改变抗原的物理性状，形成抗原储存库，延长抗原在局部组织的滞留时间，有利于抗原的缓慢释放；增强吞噬细胞的吞噬作用（被佐剂吸附的抗原易被吞噬细胞吞噬），促进对抗原的处理，刺激淋巴细胞增生，从而增强和扩大免疫应答的效应。,17,二、免疫动物,为获取高质量的抗体，除了需制备高纯度的抗原外，还需选择适宜的动物和设计有效可行的免疫方案，如抗原的剂量、剂型、注射途径、注射次数、注射间隔和接种动物的年龄均与免疫效果密切的关系。,18,1.免疫动物的选择选择动物时应考虑以下因素：抗原来源与动物种属的关系。抗原的来源与免疫动物种属差异越远，其免疫源性越强，免疫效果越好，而同种系或亲缘关系越近，免疫效果越差。动物个体的选择。适龄、健康、体重符合要求的正常动物（以雄性为佳）；抗体需要量少时，选用家兔、豚鼠和鸡等小动物；抗体需要量大时，可选用绵羊、山羊、马、驴等大动物。抗原性质与动物种类。,19,2.免疫方法选定动物后，在免疫过程中应考虑免疫剂量、免疫途径、免疫次数、免疫间隔等因素。(1)免疫原的剂量：免疫原的接种剂量按免疫原性的强弱、动物的个体状态和免疫时间来确定。首次免疫时，剂量不宜过大，以免产生免疫麻痹。,20,(2)免疫途径与免疫间隔时间免疫途径通常有皮内、皮下、肌肉、静脉、腹腔、淋巴结等，视不同的免疫方案而异。对于不易获取的宝贵抗原可采用淋巴结免疫法。免疫间隔时间是影响抗体产生的重要因素，其中首次与第二次免疫的间隔时间尤为重要，一般以1020天为佳，二次后间隔时间一般为710天，若间隔时间太长，则刺激减弱，抗体效价不高。,21,3.动物采血采集免疫血清前，要预先测试抗体效价测定，若效价达到要求，应在末次免疫后一周及时采血，否则抗体效价会下降。(1)颈动脉采血法(2)心脏采血法(3)静脉采血法,22,图1颈动脉分离图,23,三、免疫血清的纯化,1.特异性抗体的纯化免疫原不纯，导致产生杂抗体混杂于抗血清中。杂抗体的除去可采用：。(1)亲和层析法（2）吸附法,24,2.IgG类抗体的纯化IgG类抗体的纯化常用方法有盐析法、凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析等方法。(1)盐析法：硫酸铵盐析常用于-球蛋白提取，经三次沉淀后提取的-球蛋白大多属于IgG。,25,(2)凝胶过滤法：各种蛋白质成分的分子量大小不同，在通过凝胶介质时，洗脱速度也不同，从而达到分离目的。血清蛋白的分级分离常用凝胶过滤法进行，按分子大小可分为三组：第一组包括IgM和一些脂蛋白；第二组主要是IgG和较少量的IgA、IgD、IgE等球蛋白；第三组主要白蛋白、血清粘蛋白、铁传递蛋白等（见图2）。,26,图2在凝胶过滤柱上血清蛋白的层析示意图(M=IgM,G=IgG,A=IgA),27,(3)离子交换层析法纯化IgGIgG作为一种-球蛋白，在血清蛋白中带电荷较最少，用离子交换层析法易于分离。DEAE-SephadexA-50是一弱碱性离子交换剂，常用于免疫球蛋白的纯化。血清中的-球蛋白属于中性蛋白，其余均属酸性蛋白。在pH7.27.4的环境中,酸性蛋白被DEAE-SephadexA-50吸附，-球蛋白不被吸附而得以纯化。该技术纯化IgG简便，不损坏抗体结构和特异性。,28,图3在DEAE-纤维素上人血清蛋白的层析示意图(M=IgM,G=IgG,A=IgA),29,(4)亲和层析法纯化葡萄球菌A蛋白（SPA）或连球菌G蛋白具有与IgGFc段结合的能力，可用亲和层析来分离IgG。分离时可采用两种类型的亲和层析柱即SPA或G蛋白交联至Sepharose4B制成的亲和层析柱。抗血清通过层析柱时，IgG被吸附，而非特异性蛋白则未能结合被洗脱除去，然后改变洗脱条件，使IgG从层析上解离从而达到纯化目的。,30,图4亲和层析纯化IgG基本过程示意图,31,四、免疫血清的鉴定1.效价的测定：颗粒性抗原可采用凝集试验，可溶性抗原常用双向免疫扩散试验、ELISA等方法。2.特异性的鉴定：抗体特异性鉴定常用双向免疫扩散法、免疫电泳法。,32,3.纯度的鉴定：抗体纯度的鉴定可采用SDS-聚丙酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、双向扩散试验、免疫电泳等方法。IgG含有重链和轻链，纯IgG的SDS-PAGE结果应有两条蛋白电泳带（分子量约53kD和22kD），若出现多条电泳带则表明制备的抗体混有杂蛋白，需进一步纯化。4.亲和力的鉴定：测定抗体亲力的方法较多，如平衡透析法、ELISA或RIA竞争结合试验等。,33,五、免疫血清的保存4保存：存放于4冰箱，一般可可保存半年，效价高时可保存一年，但抗体活性有些降低。低温保存：是常用的抗体保存方法，将抗体分为小包装于-20-70保存，一般可保存5年抗体效价无明显下降，但要避免反复冻融。真空干燥保存：用冷冻真空干燥器进行干燥，制成干粉，封装后可在普通冰箱中保存510年抗体效价无明显变化。,34,第二节单克隆抗体的制备Preparationofmonocloneantibody,克隆(clone)是指无性繁殖细胞系，是由单一个祖先细胞分裂繁殖而形成的一簇细胞纯系。在这个家族的所有成员中，如无突变发生，其基因是完全相同的。,35,单克隆抗体（McAb）,是由只识别单一抗原决定簇的B细胞克隆产生的同源抗体。,其理化性状高度均一、效价高、只与一种抗原表位发生反应、生物活性单一，具有高度特异性又易于大量制备,36,单克隆抗体制备方法：,杂交瘤技术EBV技术,37,杂交瘤单克隆抗体?,通过抗原致敏B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，经克隆化培养所形成单克隆杂交瘤细胞克隆，所分泌的针对抗原上某一抗原表位的纯的抗体，具有生物活性单一，理化性质高度均一，产量高等特点。,38,一、杂交瘤技术的基本原理,39,一、杂交瘤技术的原理及流程,40,41,42,二、单克隆抗体制备技术,主要材料细胞融合前准备细胞融合抗体的初筛和克隆化杂交瘤细胞冻存与复苏单克隆抗体的批量生产单克隆抗体的纯化与鉴定,43,（一）主要材料：,RPMI1640培养液FCS10%谷氨酰胺2mmol/L青霉素100IU/ml链霉素100Ug/ml,44,100XHAT贮存液,H13.6mg/mlA0.019mg/mlT0.388mg/ml,45,100XHT贮存液,H13.6mg/mlT0.388mg/ml,46,8-杂氮嘌啉,8-杂氮嘌啉200mgDW:10ml加1NNaOH至溶解加DW至20ml过滤除菌分装-200C保存,47,聚乙二醇,PEG:3050%P=m/(m+v)100%,48,（二）细胞融合前准备,1.免疫方案颗粒性抗原可溶性抗原2.饲养细胞3.骨髓瘤细胞4.免疫脾细胞,49,初次免疫Ag150g加福氏完全佐剂皮下多点注射(一般0.81ml0.2ml点)3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip(ip剂量不宜超过0.5ml)3周后第三次免疫剂量同上，不加佐剂，ip(57天后采血测其效价，检测免疫效果)23周后加强免疫，剂量50500g为宜，ip或iv3天后取脾融合,50,初次免疫1100.5mlip(腹腔内注射)23周后第二次免疫1100.5mlip3周后加强免疫(融合前三天)1100.5mlip或iv(静脉内注射)取脾融合,51,小鼠腹腔巨噬细胞的制备常用BaLbc小鼠610周龄拉颈处死浸泡于75酒精，消毒35分钟用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜用无菌注射器注入68ml培养液反复冲洗，吸出冲洗液放入10ml离心管，1200转分离心56分钟用20小牛血清(NCS)或胎牛血清(FCS)的培养液混悬，调整细胞数110ml加入96孔板，100l孔放入37CO2孵箱培养,52,常用骨髓瘤细胞系有：NS1SP20X63Ag8.653,53,54,骨髓瘤细胞系选择要点：,动物品系相同不产生免疫球蛋白重链和轻链对HAT敏感融合后产生稳定性高的杂交瘤细胞,55,脾细胞悬液的制备：在无菌条件下取出脾脏，用不完全的培养液洗一次，置平皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数。一般免疫后脾脏体积约是正常鼠脾脏体积的倍，细胞数为10左右。,56,1.细胞融合2.HAT选择杂交瘤,(二)细胞融合，选择杂交瘤,57,（三）抗体初筛与克隆化,以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。常用的方法有:1.ELISA用于可溶性抗原(蛋白质)、细胞和病毒等McAb的检测。2.RIA用于可溶性抗原、细胞McAb的检测。3.FACS(荧光激活细胞分类仪)用于检查细胞表面抗原的McAb检测。,58,（四）杂交瘤的冻存和克隆化,1.克隆化方案用克隆化的方法很多，而最常用就是有限稀释和软琼脂平板法。(1)有限稀释法的程序(2)软琼脂法,59,60,2.杂交瘤细胞的冻存,细胞冻存液:50小牛血清40不完全培养液10DMSO(二甲亚砜),61,（五）单克隆抗体的大量生产,大量生产单克隆抗体的方法主要有两种：1.体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从上清中获取单克隆抗体。但此方法产量低，一般培养液含量为1060gml，如果大量生产，费用较高。2.体内接种杂交瘤细胞，制备腹水或血清。,62,（六）单克隆抗体的鉴定,1.抗体特异性的鉴定：2.McAb的Ig类与亚类的鉴定：3.McAb中和活性的鉴定：4.McAb亲和力的鉴定：,63,抗体的纯化：,硫酸铵沉淀离子交换层析SPA-sepharose亲和层析柱分离,64,第四节基因工程抗体技术GeneticEngineeringTechnique,是指应用NDA重组及蛋