病原生物学-结核病防治基础研究(下)

,如何进一步确定分枝杆菌菌种和耐药性？,结核病快速诊断方法在临床诊断中的应用,结核分枝杆菌快速诊断方法,A）结核菌核酸扩增诊断试剂盒i)CobasAmplicorii)AMTDTiii)Loop-mediatedisothermalamplificationB）基因分型方法C）实验室PCR方法（In-housePCR/qPCR）,结核菌分子诊断现状评述,只有痰检阳性的病例才能得到满意的结果商业化试剂盒：简便易用但很昂贵实验室PCR诊断方法:相对比较便宜快速主要问题：交叉污染需要严格的实验室设计和操作管理,PCR实验室工作平面图,试剂准备间（ReagentPreparationRoom）,样品准备间（SpecimenPreparationRoom）,核酸扩增室（AmplificationRoom）,产物分析间（ProductAnalysisRoom）,工作流程,实验人员,耐药分子诊断方法,商业化试剂芯片线条探针检测法实验室PCR扩增、测序,HainGenoTypeMTBDRplus,MTBID,RpoB,katG,inhA,HK$300pertest,商业化试剂,LineProbeassay,Fluoroquinolines,Aminoglycosides,ethambutol,MTBDRslforsecondlinedrugs,HK$500pertest,现有诊断试剂的局限性：经过小规模实验检验简单、使用方便昂贵（主要由欧美发达国家研制）我国的需求：简单、便宜、可在基层医院使用重大传染病防治科技重大专项等研究项目：快速诊断试剂研究,简单可行的方法,实验室PCR检测PCR扩增rpoB基因耐药相关的高度保守区（RRDR），测序，检测突变位点。时间：1周意义：1）可快速检出约90利福平耐药菌株，指导临床用药。2）提示MDR发生的可能性。,206,1349TCG(TTG)S(L)531,3225GCT(GCC)A(A)823,C,T,AnalysisofrpoBofRIF-Rstrains,126,1200ACC(ACT)T(T)481,1349TCG(TTG)S(L)531,1508TTC(TCC）F(S)584,3225GCT(GCC)A(A)823,C,C,T,T,818,RIF-D(818strain):.ACTTTGTCCGCCH37Rv:.ACCTCGTTC.GCTSequencepositioninMtb:.1200bp.1349bp.1508bp3225bpProtein:T(T)S(L)F(S).A(A)CodonpositioninMtb400.450.503.742CodonpositioninE.coli.481.531.584.823,小结：MDR/XDRTB检测,MDR/XDRTB检测程序及所需时间痰显微镜镜检:1dayIf+:DNA扩增菌型鉴定耐药基因突变检测26daysIf-:培养（液体、罗氏培养基）阳性（液体：23周；罗氏：48周）分子鉴定和耐药基因检测26天。同时做常规药物敏感实验作为标准对照,结核病诊断,细菌学诊断提高痰涂片镜检水平，及时发现高传染性病人对镜检阳性标本进行rpoB基因扩增测序，进行快速药物敏感性诊断免疫学诊断抗原特异性-干扰素检测，对潜伏感染及与其他疾病进行鉴别有一定的诊断价值。血清学检测？,VaccineDevelompment,结核疫苗研究历史,Koch继1882年发现肺结核的致病菌结核分枝杆菌后，试图从结核杆菌培养介质中得到的结核菌素作为疫苗，由于诱发强烈的迟发型变态反应，没获得成功。1906年Calmette和Gurin发现预先给小牛喂养低毒力剂量的人型结核分枝杆菌对于再次静脉注射致死剂量的人型结核分枝杆菌具有保护作用。,Calmette和Gurin分离培养牛结核分枝杆菌，经过200-235次传代，终于得到了具有免疫保护力的减毒的牛型结核分枝杆菌株BacilleCalmetteGurin，简称BCG，即卡介苗。1921年7月对母亲是结核病患者的120名新生儿通过口服途径实施了卡介苗接种，或得了较好的免疫保护效果。30年代Scandinavian地区开始使用BCG皮内注射的途径进行免疫，提高了疫苗应用的安全性。1974年BCG被纳入WHO免疫扩大计划，全世界每年有近1亿的儿童接受预防性免疫接种。,新型结核疫苗研究背景,近十几年来，结核感染发病率持续增高。传统BCG疫苗存在严重不足：新生儿接种BCG可有效保护儿童不患严重的结核感染，如粟粒性结核和结核性脑膜炎，但对成人肺结核几乎没有保护作用。成人再次接种BCG,没有增强免疫保护的作用。新型结核疫苗研究迫在眉睫。,Andersenp,NatureReviewImmunology,2005;3:656,LiveMycobacterium（recombinantBCGetc）,Subunitvaccine,Thestrategyfortuberculosisvaccinedevelopment,CitedfromAggerEM.Vaccine,2002;21:7-14,ModelofinteractionbetweenenvironmentalMycobacteriaandBCG,SensitisationwithenvironmentalMycobacteriablockstheactivityoftheBCGvaccinebutnotsubunitvaccines.,新型疫苗发展策略,Andersenp,NatureReviewImmunology,2005;3:656,结核活菌苗（重组BCG）,亚单位疫苗（蛋白多肽；DNA疫苗；病毒载体）,新型结核疫苗类型,(一)其它减毒活疫苗(二)重组BCG疫苗(三)亚单位疫苗DNA/蛋白多肽/病毒(四)营养缺陷性疫苗(五)治疗性疫苗（DNA）,1.牛型分枝杆菌减毒活疫苗BCG。2.田鼠分枝杆菌减毒活疫苗。自然突变株，保护力和BCG相当。已应用于临床实验。3.通过基因敲除/突变人型结核杆菌毒力基因，构建结核杆菌减毒活疫苗。,减毒活疫苗,减毒活疫苗BCG,近80年历史的减毒活疫苗BCG是目前仅有的预防结核病的疫苗。BCG来源于传代230代的牛分枝杆菌，一直被广泛用作预防结核病的疫苗，但多年的应用发现BCG的两大特性:1、极不稳定，地域性极强，保护效果从高达80%至某些地域的0%，有时甚至带来有害效果;2、BCG通常可有效保护新生儿及儿童免患初期疾病如结核性脑膜炎，而对青少年及成人几乎不能提供阻止后期感染性肺结核发生的保护力。BCG似为一双刃剑，有时保护，而有时毫无用处甚至有害。因此，BCG的免疫病理和毒力问题仍待谨慎的研究和探讨。,卡介苗免疫保护效果,BCG保护作用差异大的原因,BCG丢失了一些结核杆菌特异性抗原；环境分枝杆菌的作用，使BCG在体内受到抑制，不能引起有效的免疫保护作用；BCG株、剂量和接种方案存在差异；人群基因差异；结核杆菌基因差异。,BCG所缺失的结核杆菌特异性基因组区域,引自MustafaAS.MolecularImmunology,2002;39:113,重组BCG疫苗研究,重组BCG疫苗的优点,优良的佐剂和安全的载体表达多个抗原表位诱导持续的免疫记忆和高水平的细胞免疫应答,综合各疫苗优势,重组BCG疫苗,安全的载体：以BCG为表达载体。人型结核杆菌保护性抗原：Ag85B和ESAT-6，MPT64等。增强细胞免疫反应的细胞因子：IFN-r,IL-2,IL-12,G-CSF等。,构建重组BCG疫苗示意图,Aph,pMV261/361,ESAT6,Ag85b,IFN,oriE,Phsp65,连接,酶切,BamHEcoRHind,重组BCG构建策略,P,P,P,rBCG,pMV261（染色体外）与pMV361（染色体内）,pMV361整合入染色体示意图,重组MtbRD1-2F9BCG疫苗免疫保护活性增强细菌清除率改变,saline,BCG,BCG:RD1-2F9,saline,BCG,BCG:RD1-2F9,重组MtbRD1-2F9BCG疫苗免疫保护活性增强脾脏组织观察,引自PymAS.NatureMedicine,2003;9:533,重组MtbAg85BBCG疫苗(rBCG30)免疫活性增强DTH反应增强,引自HorwitzMA.PNAS,2000;97(25):13853,rBCG30免疫保护性增强体重变化,rBCG30免疫保护性增强肺脏和肝脏组织学观察,亚单位疫苗,结核蛋白/多肽疫苗概述,Koch治疗性疫苗实验PeterAnderson等发现结核杆菌培养基滤过蛋白（CFP）一定程度上具有保护小鼠感染结核的能力。这促使人们开始研究有效的亚单位疫苗。人们在早期培养滤液中发现具有明显免疫原性的蛋白质：Ag85复合体和ESAT-6。,结核蛋白质疫苗的难点在于免疫效率不够强和缺乏可用于人体的佐剂。应用于预防的研究已较多。但应用于结核治疗的研究报道尚不多。结核杆菌分泌蛋白和细胞壁蛋白是亚单位疫苗研究的主要对象。结核培养滤液蛋白，尤其短期培养滤液蛋白免疫小鼠，具有保护效果，并证实保护效力来源于CD4+T细胞。,从培养滤液中分离鉴定出有免疫原性的蛋白质有：ESAT-6、Ag85B、Mtb8.4、Mtb32A、MPT64和一38kD蛋白（PstS-1）等。其中Ag85B免疫原性被认为最强。近来的研究发现Ag85B和ESAT-6的融合蛋白免疫原性更强。,Mtb8.4具有较强的细胞免疫活性，免疫动物证明它具有很强的免疫活性。,TheantigensselectedforTBvaccine,Yin-YangModelZhangYing,ClinPharmacolTher.2007;82(5):595-600.,TraditionalmodelResuscitation,Replication,growth,death,Dormancy,ESAT-6,Ag85B,Mtb8.4,HspX,Ag85B-MPT64（190-198）-Mtb8.4(AMM)Ag85B-MPT64（190-198）-HspX(AMH),Persisters,Reverts,Dormant,Replicating,30kD分泌蛋白(Ag85)的免疫原性T细胞增殖反应,引自SinhaRK.Vaccine,1997;15:689,亚单位疫苗的特点,环境分枝杆菌存在使BCG的预防保护作用大为降低，此时亚单位疫苗具有较好的免疫保护力。免疫佐剂和细胞因子对疫苗的效应影响很大。T细胞表位对于亚单位疫苗非常关键。疫苗通过特异性表位和特异性的T细胞作用，分别激活Th1和CTL。可以作为治疗性疫苗。,引自MustafaAS.MolecularImmunology,2002;39:113,T细胞表位,亚单位疫苗佐剂,亚单位疫苗需要有效的佐剂才能引起有效的免疫应答。传统的铝佐剂主要引起Th2为主的免疫应答，显然不适合以细胞免疫为主的抗结核疫苗。理想的结核疫苗佐剂所具有的功能:()免疫调节()抗原呈递()诱导CTL反应()靶向特异性细胞()持久释放,抗原位置决定它们被呈递给不同的T细胞,寻找有效的佐剂,寻找有效的佐剂是结核亚单位疫苗发展要解决的关键问题。早在1994年Andersen用不同的免疫佐剂和结核杆菌短期培养滤液蛋白结合，发现二甲基三十六烷基铵（DDA）有较强的细胞免疫诱导活性，能诱导CD4+T细胞的增殖。,此后，他们发现单磷酸类脂A（MPL）和DDA的混合物能更好地增强小分子蛋白ESAT-6以及ESAT-6和Ag85B融合蛋白的免疫原性，增强他们的抗结核保护力。,最近他们发现了另一种更有效的免疫佐剂混合物：合成的索因子（cordfactor）trehalosedibehenate和DDA的混合物可以有效激发Th1反应，诱导强的免疫保护应答，而没有明显的毒副作用。,对于疫苗的转运方式，学者尝试用微球体来转运，并证明这对于达到一个以细胞免疫为主的并具有持久的免疫记忆力的反应是非常重要的。,微球体形式的疫苗有很多优点：1）微球体直径约1-10m，容易被树突状细胞等其它抗原呈递细胞所吞噬，从而将抗原通过MHC类和类分子呈递给效应细胞；2）包被于微球体的抗原，不易被酶降解而清除，而是在一定时间内缓慢释放。,Evans等将重组Mtb8.4蛋白包裹入PLG微球体，发现可以有效激发CD8+T细胞反应和抗体生成，所诱导的免疫反应强于蛋白与其它佐剂（如MPL）的效应，可达到DNA疫苗的免疫效果。,EvansJT.Vaccine,2004;22:1964,Mtb8.4微球体刺激脾细胞分泌IFN-,胞内细胞因子染色显示CD8+IFN-+T细胞被激活,Trehalosedimycolate(TDM)和HSP65DNA包裹入PLG微球体极大地增强了疫苗的免疫效果。,单一剂量Hsp65-TDM-PLG微球体诱导产生较强的免疫保护力,应用于结核亚单位疫苗的佐剂,细胞因子增强亚单位疫苗的免疫保护力,ConstructionofafusionproteinAMM,(a)ThetranslationproductofAMM(Ag85BMPT64(190198)Mtb8.4)withthemolecularweightof46.7kDa.(b)PurificationofAMMproducedinE.coli.AMMwaspurifiedfrominclusionbodiesbyNiNTAHisBindcolumn.M,proteinmolecularweightmarker;13,washedwithbufferCwithpH6.3;4and5,AMMwaselutedwithbuffersDandEwithpH5.9and4.5,respectively.,ConstructionoffusionproteinAMH,Adjuvantforproteinvaccine,Dimethyl-dioctyldecylammoniumbromide(DDA),onekindofcationicliposomesBCGpolysaccharidenucleicacid(BCGPSN),BCGcellsweresonicatedandthesuspensionwasmixedwithdoublevolume45%phenolnatriumaceticum.Thenitwasheatedto68for30min,thesupernatantswasconcentratedanddoublevolumeoffrostyethanolwereadded.Themixturewaswashedthreetimeswithethanolandethylether.Atlasttheextractsweredissolvedinsaline(1mg/ml)andcryodesiccatedtopowder.,UltravioletabsorptionspectrumofBCGPSN.,BCGPSNpreparedwasscannedbyultravioletabsorptionspectrumfrom190nmto360nm.ThescanshowedthatBCGPSNadjuvanthadspecialabsorptionatpeakof206nmand260nm.,BCGpolysaccharidenucleicacid(BCGPSN)Preparation,ProtectiveefficacyofBCGpriming-AMMboostingagainstH37Rvchallengeinmice,Lung,Spleen,*,*,*,*p0.05comparedtoAg85Bboost;*p0.05comparedtoPBS;*p0.05comparedtoBCG,Protectiveeffi