第7章-细菌的遗传分析.ppt

7.1细菌的细胞和基因组（掌握）7.2大肠杆菌的突变型及其筛选（了解）7.3细菌的接合与中断杂交染色体作图（掌握）7.4F因子与性导（自学了解）7.5细菌的转化与转导作图（掌握）7.6细菌同源重组的机制（自学了解）,第七章细菌的遗传分析,本章主要以大肠杆菌（E.coli）为材料，讨论：1、细菌的遗传物质的传递规律2、细菌染色体作图3、细菌同源重组的分子机制,7.1细菌的细胞和基因组,7.1.1细菌的细胞7.1.2细菌的基因组,7.1.1细菌的细胞,E.coli的菌落colony,细菌:真细菌（eubacteria）如大肠杆菌（Escherchiacoli）古细菌（archaebacteria）如詹氏甲烷球菌（Methanococcusjannaschii）多种形态存在：球菌（cocci）杆菌（bacilli）螺旋菌（sprilla）等大小：随种类不同而异杆菌一般长15，宽0.51；球菌以直径大小表示，一般为0.51；螺旋菌一般长为150，直径为0.51,细菌的基本结构：细胞壁、细胞膜、拟核、核糖体、细胞质及内含物；细菌的特殊结构：如荚膜和鞭毛遗传物质环状核酸分子，也可称染色体。单细胞菌落（clone）/菌株（strain）世代时间短，20分钟一代，容易得到生化突变型。原养型prototroph营养缺陷型auxotroph细菌与细菌之间可有遗传物质的交换,经渗透处理的E.Coli释放出来的DNA，其染色体长度1200m,细菌染色体不凝缩，没有着丝粒，也没有纺锤体结构。细菌繁殖：双链环形DNA分子随着细胞伸长而采取二分分裂（binaryfission）的方式分开。,细菌染色体的复制与细胞二分分裂,7.1.2细菌的基因组,细菌染色体大多为裸露的环状闭合DNA双链，没有组蛋白和其他蛋白质结合，也不形成核小体结构。位于细胞内一个称为“拟核”（nucleoid）的区域中。这种结构有利于外源DNA的插入。细菌的染色体长度为25035000m不等。,拟核结构,电镜观察表明：拟核结构最显著的特征是其DNA被包裹压缩成一个个有序的环状结构域(loopdomain)。大肠杆菌基因组长4639229bp，在松弛状况：1333m长，而其细胞长度约为2m、宽1m，必须压缩最少1000倍后才能装入细胞中。对拟核成分分析表明，DNA占80，其余为RNA和蛋白质。已分离出HU、H1等DNA结合蛋白，类似于真核染色体的结构蛋白，可能与结构域的形成有关。大肠杆菌拟核中约有100个结构域，每个相当于40kb，各个结构域具有相对的独立性。染色体(拟核)的结构域是超螺旋结构。这是DNA双螺旋的螺旋轴盘绕而形成的螺旋，是DNA三级结构的一种形式。,如用DNA酶处理大肠杆菌拟核，各结构域DNA链将会断裂，超螺旋结构受到破坏，变为松弛型结构。拟核的中央部分为支架蛋白和RNA。若用RNA酶处理，拟核中DNA的折叠结构即不能保持，说明RNA和支架蛋白是保持拟核结构的重要因素,细菌染色体以高度组装的形式存在,E.coli的染色体为闭合双链环状DNA，长约1333m.1997年测定完成E.coliK-12MG1655菌株全基因组:4639229（约4.7106）bp其中：87.8编码蛋白质0.8编码稳定性RNA0.7%无编码功能的重复序列11属调节序列和具有其它功能在编码蛋白质序列：总共编码4288种已知和未知的蛋白质（可读框），其中约38功能不明。,E.coli的全基因组概况,在K-12MG1655菌株中，基因的平均长度为950bp,基因之间的平均间隔约为118bp，但是菌株之间可能会有很大的差别。2005年报道了第二个菌株E.coliK-12W3110基因组的完整序列。比较K-12MG1655菌株和K-12W3110菌株，发现两者基因组大小并不是一致的：K-12W3110基因组大小为4646332bp，基因总数为4464个K-12MG1655基因组大小为4639229bp，基因总数为4288个,E.coli的全基因组概况,E.coli的全基因组,仅显示部分基因注意图距单位：min,7.2大肠杆菌的突变型及其筛选,7.2.1大肠杆菌的突变类型（1）合成代谢功能的突变型（anabolicfunctionalmutants）野生型品系在基本培养基上具有合成所有代谢和生长所必需的复杂有机物的功能，这称为合成代谢功能（anabolicfunction）。这需要大量基因的表达，其中任何一个必需的基因发生了突变都不能进行一个特定的生化反应，从而阻碍整个合成代谢功能的实现，这种突变型称为营养缺陷型。它们多是条件致死突变（conditionlethalmutation），因为能通过在基本培养基中添加所需的有机成分使具有这种突变的细菌存活。,（2）分解代谢功能的突变型（catabolicfunctionalmutants）野生型大肠杆菌能利用比葡萄糖复杂的不同碳源，因为它能使复杂的糖类转化成葡萄糖或其他简单的糖类，也能将复杂分子，如氨基酸或脂肪酸降解为乙酸或三羧酸循环的中间物。这些降解功能称为分解代谢功能（catabolicfunction）。同样，一系列降解功能的实现也需要许多有关基因的表达，其中任何一个基因的突变都会影响降解功能的实现。如Lac突变型不能分解乳糖，因此就不能生长在以乳糖为唯一碳源的基本培养基中，而野生型Lac细菌都能利用乳糖。Lac表型可能是因为lacZ或lacY基因发生突变，分别产生了基因型为lacZ或lacY的突变型菌株。这种菌株显然亦是条件致死突变型。,（3）抗性突变型（resistantmutants）细菌由于某基因的突变而对某些噬菌体或抗生素产生抗性（resistant）。对噬菌体的抗性突变往往是以某种方式改变细菌的膜蛋白，从而某种噬菌体不能吸附或吸附在这种突变细菌上的能力降低。对抗生素产生抗性的突变是一个严重的公害问题，所以研究得也较深入，而且细菌对各种抗生素的抗性机制各不相同。如对链霉素抗性突变的细菌是由于核糖体的30S亚基的S12蛋白变异，链霉素能和敏感细菌（野生型）的S12结合，从而使翻译过程发生差错或者使翻译过程的启动作用失效。而抗链霉素突变型的S12不再和链霉素结合，因此抗性突变细菌可以在链霉素存在的情况下，进行正常的翻译作用和正常的分裂繁殖。,7.2.2细菌的培养与突变型筛选,影印培养法,7.3细菌的接合与中断杂交染色体作图,细菌中，大肠杆菌（E.coli）是最为广泛的遗传学实验材料细菌的遗传重组可以通过三种途径来实现：（1）接合（conjugation）：细菌细胞经直接接触，把一个细胞（供体）的遗传物质传递给另一个细胞（受体），从而实现遗传重组。接合能传递大段的DNA，在细菌的遗传重组中是效率最高的。（2）转化（transformation）：是指游离的细菌DNA片段被吸收到不同的细菌细胞内（受体）。（3）转导（transduction）：是指一种细菌的DNA片段经过温和的或经有缺陷的噬菌体传递给另一种细菌。,7.3.1细菌的接合,注意实验设计的严谨性严格的对照control多重营养缺陷型,1946年，Lederberg和Tatum的实验结果说明了什么？,结果A+B混合培养后的菌液涂布在基本培养基上可以1/107的频率长出原养型菌落，而单独的A和B则不能在基本培养基上生长。,1.A、B两个菌株之间发生杂交导致某种形式的遗传重组？2.原养型菌落的出现不一定是基因型的改变，可能是培养上的互补，即一些物质从一个品系的细胞中泄漏出来而被另一个品系的细胞所吸收？3.还是另一种可能，是基因型的改变，但不一定是由于两个品系间的杂交，而是一个品系的DNA片段逸出细胞后，携带着相应的基因（如met+bio+）进入另一个品系的细胞，因为这种转化作用而产生了上述的原养型？,实验结果可能的解释：,澄清上述问题U型管实验：1950年Davis：U型管实验，有力地支持了细菌菌株杂交的判断。他用一个U型管，在底部用一块过滤器隔开，把管分隔为相等的两臂。滤器的孔很小，细菌不能通过，只有象DNA这样0.1微米的游离分子、培养液和营养物质可以通过。U型管两臂中分别为营养缺陷型品系A和B，使它们繁殖到饱和状态，同时在U型管的一端交替地吸和压，使两臂中的培养液充分混合，但细菌的两个品系的细胞却不会接触。在U型管中培养一些时间后，再从两端分别取细菌进行培养，没有发现一个细菌能在基本培养基上生长。,两种细胞之间的物理接触是接合重组的必要条件,F因子与细菌的接合,F因子：fertilityfactor致育因子或性因子。是游离于细菌染色体外的闭合环状DNA，但有时也可整合至染色体上,F细胞：含有F因子，供体F细胞：不含F因子，受体,F因子的结构,F因子包含3个区原点origin：转移的起点致育基因：编码生成菌毛的蛋白，形成接合管配对区：与染色体多处区域配对，可使F因子整合至染色体上,高频重组highfrequencyofrecombination，Hfr,F与F之间杂交只有F因子的传递，而细菌的染色体并不转移，因此尽管F因子转移频率很高，但两者染色体之间重组频率很低，大约是每百万个细胞中发生一次重组，因此F品系称为低频重组（lowfrequencyrecombination，Lfr）。F因子也可以整合到细菌染色体中，像这种带有一个整合的F因子的品系则称为高频重组（highfrequencyrecombination，Hfr），因为Hfr细胞与F细胞接合后可以将供体染色体的一部分或全部传递给F受体，当供体和受体的等位基因带有不同标记时，在它们之间就可以发生重组，重组频率可达到10-2以上，故称Hfr品系。F因子：整合的F因子偶尔也能离开细菌染色体回到细胞质中，少数情况下，脱离染色体时，可以携带寄主的少数基因，形成环状的F。这种含有细菌染色体基因的F因子叫做F（Fprime）因子,根据F因子存在的状态不同而将细菌分为：F菌株：缺乏F因子。F菌株：具有游离的F因子。Hfr菌株：F因子整合到宿主染色体上。F菌株：带有部分宿主染色体的游离F因子。,由此也决定了它们之间的接合性能和遗传重组的频率：FF，不能接合，因为相互排斥。FF，不能接合，因无F因子不能形成接合管。FF，可接合并将受体F转化为F，但为低频重组。HfrF，可接合，受体一般为F，但为高频重组。FF，可接合，并将受体F转变为F，并对所携带的宿主基因是高频重组。,细菌重组的特点,Hfr与F细胞之间接合，通常只有部分的供体染色体DNA进入受体。内外基因形成部分二倍体,部分二倍体区发生奇数次交换导致线性染色体，该细胞不能存活,部分二倍体区发生偶数次交换形成重组的环状染色体，该细胞可存活,细菌重组的特点：基因转移是单方向的，仅供体受体这与真核生物减数分裂中染色单体间交换导致的重组不同,7.3.2中断杂交与重组作图,（1）中断杂交（Interrupted-matingexperiment）实验原理Wollman和Jacob想了解Hfr品系在杂交时，什么时候把它的基因转入F细胞，进行了一些实验，其中中断杂交实验对E.coli的遗传研究作出了重大的突破。,Hfr菌株thr+leu+azirtonrlac+gal+strsF-菌株thrleuazistonslacgalstrr,azi叠氮化钠；ton:噬菌体T1；str:链霉素；lac:乳糖；gal:半乳糖,接合采用Hfr菌株为strs，F菌株为strr，混合通气培养(细菌与细菌开始接触)形成接合管。接合在完全培养基上进行，培养基以葡萄糖为碳源，不加链霉素、叠氮化钠和噬菌体T1。中断接合在接合处理后的不同时间搅拌（断开接合管,使配对的细菌分开）和提取样品，从而获得不同接合时间（min）的细菌样品。杀死Hfr将不同接合时间的细菌样品稀释后接种在含有链霉素的完全培养基上，结果对链霉素敏感的Hfr菌株被杀死，只有F细菌存活。检查F细菌所含供体基因将获得不同接合时间的F细菌样品都分别接种在含叠氮化钠，含噬菌体T1，含乳糖而无葡萄糖，含半乳糖而无葡萄糖的培养基上，统计各供体基因出现的频率。作图根据各基因出现时间先后的顺序将它排列在染色体上，并标明出现的时间，而各基因出现时间的差数就是它们之间的距离，这种图距是以时间（min）为单位的，有别于真核生物遗传作图时以厘摩（cM）为单位。,Hfr菌株thr+leu+azirtonrlac+gal+strsF-菌株thrleuazistonslacgalstrr,中断杂交结果：,这种根据供体基因进入受体细胞的顺序和时间绘制连锁图的技术，称为中断杂交技术（Interruptedmatingtechnique）。营养缺陷型突变基因在杂交试验中有选择重组型排除亲代型的作用，所以称为被选择的标记基因。结果发现Hfr的未选择性标记基因进入F所需时间：分钟转移的Hfr基因909azir11azirtonr18azirtonrlac+25azirtonrlac+gal+,（2）中断杂交作图,F因子在细菌染色体上有许多插入位点，而且其插入片段的取向不同而形成不同的Hfr品系。用这些不同Hfr菌株进行中断杂交实验，则它们的转移起点、基因转移顺序以及转移方向都不相同,E.coliK12的部分遗传图注意图距单位：min,（3）重组作图,基因距离较远用中断杂交作图是很有效的，但是基因距离较近，基因间转移时间在2min之内，那么仅用中断杂交实验进行基因定位就不十分精确可靠。这时可用传统的重组作用法（recombinationmapping）例如：根据中断杂交试验（时间单位法），已知lac和ade这两个基因是紧密连锁的，在某些品系的杂交中ade基因是后于lac进入F细胞的。问两基因间的距离为多少？,以下杂交：HfrlacadestrsFlacadestrr重组子adestrr在含有链霉素的基本培养基上，Hfr细菌被杀死，因其为strs未杂交的Flacadestrr也死亡，因为是腺嘌呤缺陷型所以选出来的重组子都是adestrr因为ade是在lac之后进F细胞，所以我们选出的Fadestrr，一定是由同时得到lac和ade的下图显示了该杂交组合可能的交换情形,Flacade,Flacade,Flacade,Flacade,lac和ade之间未交换,lac和ade之间单交换之一，产生重组子，但不能生长，因为是腺嘌呤缺陷型,lac和ade之间单交换之二产生重组子,lac和ade之外双交换，但产生的不是lac和ade间的重组子,计算lac和ade之间的重组率,1、选择在腺甘酸（ade）缺乏的培养基上生长的类型。它们表明ade基因已转入细胞。2、选出的lacade类型即是重组子，因为位于后面的ade都已进入，表明lac也已进入，而lacade表型就是供体受体lac、ade两个基因间发生交换的结果。可用此来计算重组值。所以，它们的重组率，也可代表基因间的距离,RF,时间图距与重组率图距的关系,用时间单位法测得这两个基因间的距离是1分钟，用重组法测得的重组值是20。用重组率（RF）所测得的基因间距离与用中断杂交以时间（T）为单位的基因间距离基本上是一致的。两个值的比：RF:T约等于20，即它们之间关系大约是1min等于20个图距单位（cM）。所以大致上是，1个时间单位（1分钟）相当于20重组值。大肠杆菌染色体全长约100min，含4106核苷酸对，所以总图距相当于2000cM，故1cM2000bp。这种接合重组作图在短距离内是有效的。如相距2min以上的就有可能表现不连锁。同时这种接合重组不产生交互重组类型，所以用这种方法得出的图距和减数分裂生物中所确定的图距不同。,7.5细菌的转化与转导作图,7.5.1细菌的转化与作图7.5.2细菌的转导与作图,7.5.1细菌的转化作图,细菌的转化:DNA直接转入受体细胞的过程。环状DNA转化：整体进入整合。片段DNA转化：单链进入整合。在实施以上步骤时：一般要对受体细胞进行处理：化学处理或用强电场处理（electroporation，电穿孔）。目的是增加受体细胞膜对供体DNA的可透性。制备感受态细胞（competentrecipientcell）：能吸取DNA分子而被转化的细菌细胞叫做感受态细胞。在某一细菌群体中，只有极少数细胞是感受态的，它们具有感受因子（competencefactor），可能是细胞表面的一种蛋白质或是一种转化酶（translocase），它参与DNA的吸收。,转化过程可以分为几个步骤：双链DNA分子和细胞表面感受位点可逆性的结合。供体DNA片段被吸入受体细胞。侵入受体细胞的供体双链DNA转变成单链形式，其中一条链被降解。未被降解的一条链部分或整个地与受体DNA链进行交换重组，形成杂合的DNA分子（heteroduplexDNA）。这种杂合的DNA复制以后，形成一个亲代类型（受体）的DNA和一个重组类型的DNA并导致转化细胞的形成与表达。,通过转化确定基因连锁、基因顺序和图距：在转化过程中，DNA小片段受体。相距很远的二个基因很难同时存在于一个DNA片段中，若两个基因的二个片段同时进入受体，一般不能同时进行转化的，按照概率定律，两个片段同时转化的概率是它们的单独转化的概率的乘积，这种概率是很低的。两个基因紧密连锁时，它们就有较多的机会包括在同一个DNA片段中，并同时整合到受体染色体里共转化（cotransformation），共转化的基因一般是连锁的。,共转化频率的计算：例：在一个转化实验中，用a+b+品系的供体DNA，转化基因型ab的受体品系，得到的转化类型和数目：a+b+307a+b215ab+278,转化子的总数是800,（用a+作为选择）问b位点与a位点共转化的频率是多少？,用共转化确定基因顺序：例如：如果基因p和q常常一起传递到受体，这样两个基因可能是相对地紧密连锁，同样基因q和o也经常一起传递到受体细胞。这两个基因也是彼此连锁的。两种可能的排列顺序：poq和pqo。若顺序是poq，这样p和o必将共转化,因为它们比p和q靠得更紧密。若顺序是pqo，这样p和o将很少或根本不发生共转化，因为它们离得相对较远。结果表明没有p和o的共转化，说明基因顺序肯定是pqo,基因顺序和图距的计算：例如：用枯草杆菌（Bacillussubtilis）的一个菌株trp2his2tyr1作供体，提取DNA，向受体trp2his2try1菌株进行了转化，得到转化子类型如下：,问3个基因间的距离和排列顺序如何？,基因顺序和图距的计算：,注意：计算trp2和his2之间的重组值时，685个trp2his2是与供体trp2his2这2个基因之间未发生交换的细胞数，因此不能统计在内,供体DNA片段,受体菌染色体DNA,3基因片段转化时可能的交换类型及其重组子,7.5.1细菌的转导作图,细菌的转导:转导就是以病毒作为载体把遗传信息从一个细菌细胞传到另一个细菌细胞。转导可分为:普遍性转导（generaltransduction）局限性转导（restrictedtransduction）烈性噬菌体的感染周期温和噬菌体的感染周期,（1）烈性噬菌体的增殖感染宿主细胞后就进入裂解反应，使宿主细胞裂解。整个过程包括：吸附侵入生物合成装配裂解释放,（2）温和噬菌体的增殖噬菌体感染周期有2种途径：裂解周期lyticcycle溶源周期lysogeniccycle,普遍性转导,在噬菌体的裂解周期接近完成时，病毒DNA被包进蛋白质外壳。那么转导噬菌体是如何形成的呢？1965年，K.Ikeda和J.Tomizawa对E.coli的温和噬菌体P1的一些实验研究阐明了转导噬菌体是如何形成的。他们发现当一个非溶源性的细菌细胞（供体）被P1裂解时，细菌的染色体DNA断裂成一些片段，接着在细菌细胞中合成了噬菌体的外壳蛋白。当复制的噬菌体DNA被包装到蛋白质外壳时，偶然地也会把纯粹是细菌的DNA片段包装到一个噬菌体外壳中，形成所谓转导颗粒（transducingparticle）/转导病毒,普遍性转导,转导病毒（Transducingphages），其产生的频率非常低（105107）。由于噬菌体外壳蛋白决定噬菌体附着细胞表面的能力，因此，这种噬菌体颗粒仍然具有侵染性。它感染细菌细胞，并将其内含物细菌的DNA片断注入其中。进入的DNA片段可以和寄主细胞DNA发生重组，形成遗传结构发生重组的细菌细胞转导子（transductant）转导的细菌DNA片段长度大约为一个病毒基因组的大小，细菌染色体比病毒的染色体大得多，细菌染色体断裂后形成非常多的片段，到底在转导过程中，被包进病毒外壳蛋白的中是那个片断，完成是随机的，所以称作普遍性转导,普遍性转导作图,（1）共转导频率的计算确定基因之间的次序和距离一般性转导和转化很相似。两个基因同在一起转导就是共转导（cotranduction）。共转导的频率愈高，表明两个基因在染色体上的距离愈近，连锁愈密切；相反，如果两个基因的共转导很低，说明其距离较远，因此，测定两基因的共转导频率就可以确定基因之间的次序和距离。A.两因子转导（two-factortranduction）计算方法与共转化计算方法类似B.三因子转导（three-factortranduction）,普遍性转导作图,例如供体的基因型为a+b+c+，受体的基因型abc，在一个三因子转导杂交实验中，将产生各种不同的转导体。由于两个基因（a+b+或b+c+）共同进入一个转导颗粒的机率和它们之间的距离成反比。即二基因距离愈近就愈可能被包装到同一个转导子中并共同转移到同一个受体细胞中，形成一个共转导子a+b+。,转导作图中两个基因ab之间的重组率计算,转导作图例子,用E.colitrpAsupCpyrF供体细胞和trpAsupCpyrF作为受体由P1噬菌体媒介转导进行三因子转导杂交实验结果：,问：它们的基因顺序？共转导频率？,转导作图例子,解：上述三个基因在遗传图上的顺序可以从第3种转导型上立即判断出来，因为它是四次交换导致中间位置基因改变，其数目最少（等于0）三个基因的次序：supCtrpApyrF,转导作图例子,supC+和trpA+二基因共转导形成第1和第2两种转导型，因此，supCtrpA的共转导频率是（36+114）/603=0.25同理：supCpyrF的共转导频率是：36/6030.06三基因在遗传图上顺序和相对距离是：,共转导率越高说明两基因靠得越近，反之，越远,转导作图中共转导率与图距的关系,1966年，T.TWu(HarvardUniversity)得到了一个共转导率与从接合实验中得到的图距相连系的数学表达式：x=(1d/L)3x：两个基因的共转导频率d：染色体上两基因间的距离（以分钟计，min）L：转导DNA的平均长度（以分钟计，min）(对于P1噬菌体转导，这个长度L约为细菌染色体的2%，即2min)