第十一章-抗生素类药物的分析PPT课件

.,1,第十一章,抗生素类药物的分析,.,2,第一节概述,一、抗生素药物的特点（一）定义抗生素（antibiotics）在低微浓度下即可对某些生物的生命活动有特异抑制作用的化学物质的总称。,.,3,（二）抗生素的来源,1、生物合成（发酵）：生物包括微生物（真菌、放线菌、细菌等）、植物、动物。,2、化学合成或半合成,.,4,（三）抗生素质量的复杂性,产品稳定性差,分子结构大多不稳定，降解后疗效下降、失效或增加毒副作用,同系物多；异构体多；降解物多,化学纯度低,生产工艺复杂，发酵过程不易控制,活性成分易发生变异,.,5,二、抗生素药物的质量分析抗生素药物的质量控制方法与一般化学药品一样，通过鉴别、检查、含量（效价）测定三个主要方面来判断其质量的优劣。,.,6,（一）鉴别实验（理化方法）1官能团的显色反应2光谱法3色谱法4生物学法（抑菌能力）,.,7,（二）检查1影响产品稳定性的指标2控制有机和无机杂质的指标3与临床安全性密切相关的指标4其他指标,.,8,（三）含量测定或效价测定1微生物检定法以抗生素对微生物的杀伤或抑制程度为指标来衡量抗生素效价（potency）的一种方法。其测定方法有稀释法、比浊法、管碟琼脂扩散法,.,9,优点,1、与临床效果一致2、灵敏度高3、干扰物质少,缺点,1、操作繁琐2、培养时间长2、测定误差大,.,10,2理化方法根据抗生素的分子结构特点，利用其特有的化学或物理化学及反应而进行的。,.,11,3、抗生素活性表示方法抗生素的活性以效价单位表示，即指每毫升或每毫克中含有某种抗生素的有效成分的多少。用单位（u）表示或微克（g）表示。,.,12,三、抗生素的分类（按结构与性质）：内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类、大环内酯类、多烯大环类、多肽类苯烃胺类、蒽环类,.,13,本类抗生素包括青霉素族和头孢霉素族，它们的分子结构中均含有-内酰胺环，因此统称为-内酰胺类抗生素。,第二节-内酰胺类抗生素,.,14,（一）青霉素类,.,15,青霉素,（青霉素G、苄青霉素）,.,16,阿莫西林（羟氨苄青霉素）,.,17,普鲁卡因青霉素,.,18,（二）头孢菌素类,.,19,头孢氨苄,N,O,N,H,S,C,H,3,C,O,O,H,O,C,N,H,2,C,H,.,20,头孢拉啶,.,21,头孢羟氨苄,.,22,酸性,一、化学性质,1、与碱金属(Na+、K+)成盐，易溶于水,（一）羧基：酸性,.,23,2、与有机碱（普鲁卡因）成盐,难溶于水,普鲁卡因青霉素,.,24,（二）手性C：旋光性,（5%头孢唑啉钠溶液1824）,2、头孢菌素类C6C7,1、青霉素类C3C5C6,旋光性,.,25,（三）共轭体系：UV吸收特性,1、青霉素类母核无明显UV多数有苯环取代基,.,26,青霉素钠UV7-20,.,27,.,28,（四）内酰胺环：不稳定性,水溶液不稳定,干燥纯净稳定,不稳定性因素,四元环张力大,酰胺键易水解,.,29,.,30,例,青霉素的降解反应,青霉素,青霉噻唑酸,H2O/OH,青霉素酶,青霉酸,H2O,pH2,100,青霉噻唑酰基羟胺酸,NH2OH,青霉烯酸,pH4,青霉胺,CO2,青霉醛,HgCl2,.,31,例：头孢噻吩钠水溶液2524h失活8%,.,32,二、鉴别反应（一）呈色反应,1、羟肟酸铁反应,-内酰胺类,.,33,2、类似肽键的反应（1）茚三酮反应,-氨基,.,34,（2）双缩脲反应,-内酰胺类,似肽键,.,35,3、其他呈色反应（1）与重氮苯磺酸反应,酚羟基,例：头孢哌酮,.,36,（2）与变色酸-硫酸反应,青霉素阿莫西林氨苄西林,活泼“-CH2-”,.,37,.,38,.,39,（3）与H2SO4-HNO3反应,头孢菌素类,.,40,（4）与铜盐反应,橄榄绿色,NaOH,专属反应,HAc,头孢氨苄,.,41,二、,（二）各种盐的反应1、K+、Na+的火焰反应,鉴别,.,42,2、重氮化-偶合反应,芳伯氨基,.,43,3、遇酸,在过量HCl或有机溶剂中溶解,.,44,1、IR法,-内酰胺环,酰胺,（三）光谱法,羧基,.,45,.,46,2、UV法,样品、分解产物,头孢氨苄max=262nm,青霉素V钠A280nm/A264nm=1.301.50,Cu2+,.,47,.,48,氯唑青霉素3410.682,双氯青霉素3420.653,苯唑青霉素3391.328,(nm),.,49,（四）色谱法,1、TLC法,对照品对照法,2、HPLC法,.,50,三、特殊杂质的检查,本类抗生素的特殊杂质主要有高分子聚合物、有关物质、异构体等，一般采用HPLC法控制其限量，也有采用测定杂质的吸收度来控制杂质量的。,.,51,（一）聚合物中国药典对头孢他啶、头孢哌酮钠、头孢噻肟钠等规定了各自聚合物的检查。（二）有关物质和异构体通常采用色谱法（HPLC、反相TLC法等）检查-内酰胺类抗生素中的有关物质和异构体。,.,52,（三）吸收度药典常采用测定杂质吸收度的方法来控制本类抗生素的杂质含量。例如：将青霉素钠（钾）配成1.80mg/ml的溶液，在280nm处的A0.10（控制杂质量）；264nm处的A为0.800.88（检查药物量）。,.,53,四、含量测定,本类药物多采用理化测定方法进行含量测定，Chp收载的主要方法有：碘量法、电位配位滴定法、可见紫外分光光度法、HPLC法等。,.,54,（一）碘量法,1、原理,水解产物,定量过量,剩余,-内酰胺类,（水解）,-,4,8,2,I,I,NaOH,头孢菌素族,青霉素族,.,55,反应分两步进行：（1）水解反应(按化学计算量进行)（2）氧化-还原反应(无固定的量关系，受温度、PH值和时间等因素影响，应严格控制反应条件并采用标准品平行对照测定),.,56,2、方法,.,57,空白试验,A、消除样品已降解产物的干扰B、消除样品中其他消耗碘的杂质的干扰C、消除碘挥发造成的误差,以未经水解的样品作空白测定,.,58,采用标准品平行对照测定,A、可消除温度、pH、操作、环境等条件的影响B、使本法测定结果与微生物检定法一致,.,59,3、条件,（1）弱酸性pH4.5,碱I2IO3-+I-,酸普鲁卡因与碘在酸性条件下会产生复盐沉淀,（2）温度2426,温度38未水解的供试品亦消耗碘,.,60,（3）水解时间,以水解20分钟后的耗碘量最大,（4）反应时间,反应20分钟后，耗碘量随时间的变化较小，可减少含量测定的误差。,.,61,4、特点,（1）灵敏度高,样品:碘=1:8,（2）反应条件、实验操作要求高,加试剂次序、反应时间、滴定速度相同,4I28I-,.,62,5、计算,.,63,（二）电位配位滴定法汞量法,1、原理：青霉素族,（水解）,.,64,2、方法,样品,以未经水解的样品作空白测定,(,),.,65,例,苯唑西林钠含量测定,取本品约50mg，精密称定，加水5ml溶解后，加1mol/L氢氧化钠溶液5ml，摇匀，放置15分钟，加1mol/L硝酸溶液5ml，醋酸盐缓冲液(pH4.6)20ml及水20ml，摇匀，照电位滴定法(附录A),用铂电极为指示电极，汞-硫酸亚汞电极为参比电极，在3540，用硝酸汞滴定液(0.02mol/L)缓慢滴定,（控制滴定过程约为15分钟），不计第一个等当点，计算第二个等当点时,.,66,消耗滴定液的量。每1ml硝酸汞滴定液(0.02mol/L)相当于8.029mg的总苯唑西林(按C19H19N3O5S计算)。另取本品约0.5g，精密称定，加水与上述醋酸盐缓冲液各25ml，振摇使完全溶解，在室温下，立即用硝酸汞滴定液(0.02mol/L)滴定，终点判断方法同上。每1ml硝酸汞滴定液（0.02mol/L）相当于8.029mg的降解物（按C19H19N3O5S计算）。总苯唑西林的百分含量与降解物的百分含量之差值即为苯唑西林的含量。,.,67,3、讨论,（1）以第二次滴定突跃为终点电位法指示终点,（2）反应摩尔比1:1,（3）空白试验消除已降解产物干扰,（4）优点不需标准品,.,68,4、计算,%,W,F,T,V,%,W,F,T,V,%,100,-,100,=,空,空,样,样,含量,.,69,1、硫醇汞盐法,（1）原理,青霉素族,（三）可见-紫外分光光度法,.,70,（2）方法,对照品法,pH9,（3）讨论,a、咪唑催化的水解产率高，硫醇汞盐稳定（3h）,.,71,b、侧链有-NH2时，需加醋酐先将其乙酰化后才能发生上述反应,.,72,（4）特点,a、简便快速b、用标准品对照，重现性良好，RSD1%,.,73,（水解）,2、酸水解铜盐法,（1）原理,稳定剂,青霉素族,.,74,（2）方法,（3）特点,实验条件随各药物稳定性不同而定,标准品对照法,.,75,3、羟肟酸比色法,红色,-内酰胺类,NaOH,-,b,2,HCl,NOH,H,内酰胺类,.,76,（四）HPLC法,头孢菌素类,内标法校正因子,外标法,特点快速、高效、灵敏专属性强、重现性好一法多用（鉴别、检查、含测）,.,77,哌拉西宁原料药含量测定色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇0.2mol/L磷酸二氢钠溶液10氢氧化四乙基铵溶液水（400503547）用磷酸调节pH值至5.5为流动相。检测波长为254nm。,.,78,第三节氨基糖苷类抗生素,链霉素双氢链霉素新霉素卡那霉素庆大霉素巴龙霉素,.,79,链霉胍+链霉糖+N-甲基-L-葡萄糖胺,.,80,链霉胍,链霉糖,N-甲基-L-葡萄糖胺,.,81,链霉胍,链霉糖,N-甲基-L-葡萄糖胺,.,82,绛红糖胺+脱氧链霉胺+加洛糖胺,.,83,绛红糖胺,紫素胺,2-脱氧链霉胺,加洛糖胺,N-甲基-3-去氧-4-甲基戊糖胺,.,84,.,85,庆大霉素C复合物庆大霉素C1R=HR1、R2=CH3庆大霉素C2R=R2=HR1=CH3庆大霉素C1aR、R1、R2=H庆大霉素C2aR=CH3R1=R2=H庆大霉素C2bR=R1=HR2=CH3,.,86,一、化学性质,链霉素3个,庆大霉素5个,旋光性,（三）,.,87,链霉素pH57.5庆大霉素pH212,链霉素max230nm,.,88,.,89,羟基胺结构,-氨基,.,90,（二）Molisch试验（糖类反应）,.,91,（Elson-Morgan反应）,.,92,链霉糖特有反应,H+,分子重排,.,93,8-羟基喹啉,-萘酚,链霉胍特有反应,.,94,庆大霉素无UV吸收,.,95,三、特殊杂质检查及组分分析,链霉素B（甘露糖链霉素）,2、方法TLC中的对照品法（BP）,1、来源反应中间体,.,96,发酵菌种不同工艺差别,规定控制各组分的相对百分含量,ChPUSPBPJP,.,97,.,98,1-烷基硫代-2-烷基异吲哚衍生物,.,99,RPHPLC,规定C12550%C1a1540%C2a+C22050%,峰面积归一化法,.,100,.,101,链霉素、庆大霉素,（一）微生物检定法本法系利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用量反应平行线原理的设计，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。,.,102,（二）HPLC法：血清中庆大霉素的测定,血浆样品的预处理离子对色谱法的目的：除去氨基酸、肽、胺的干扰选用OPA为荧光衍生化试剂采用柱后衍生化法,.,103,第四节四环素类抗生素,A,B,C,D,.,104,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,.,105,四环素（TC）tetracycline,.,106,金霉素(CTC)chlortetracycline,氯四环素,.,107,土霉素(OTC)oxytetracycline,氧四环素,.,108,.,109,一、结构与性质,.,110,.,111,.,112,1、差向异构化：A环,淡黄黑,蓝色荧光,.,113,差向四环素,.,114,（土霉素、多西环素不易差向异构化）,.,115,2、降解反应：C环,（1）酸性下降解,max=445nm,max=435nm,橙黄色,.,116,脱水四环素,.,117,TC,ETC,ATC,EATC,.,118,（2）碱性下降解,.,119,二、鉴别试验,.,120,（二）FeCl3反应,.,121,（三）Cl-反应,（四）TLC法,正相分配薄层色谱,EDTA克服痕量金属造成的拖尾现象,.,122,（五）荧光法,UV,绿色荧光,.,123,三、特殊杂质检查,4-差向四环素（ETC）脱水四环素（ATC）差向脱水四环素（EATC）盐酸金霉素（CTC）,TLC法（1995版）,HPLC法（2000版）,标准品对照法,例：盐酸四环素,.,124,四环素有关物质TLC图,4,0.5,0.5,2,.,125,nm,max,355,268,、,盐酸四环素,.,126,杂质吸收度,.,127,四、含量测定,ChP、USP,HPLC法（外标法）,系统适用性试验1、防护柱2、预试溶液4-差向脱水四环素四环素3、RSD2.0%,.,128,第五节抗生素类药物中高分子杂质的检查,一、抗生素药物中高分子聚合物的定义、来源与分类,1、定义：药品中分子量大于药物本身的杂质总称。,.,129,2、来源：（1）外源性杂质蛋白、多肽、多糖类抗生素与蛋白、多肽、多糖等的结合物。主要来自发酵工艺。（2）内源性杂质药物的自身聚合物。来自于生