细胞生物学研究方法

第三章细胞生物学研究方法,第一节细胞形态结构的观察方法,第二节细胞组分的分析方法,第三节细胞培养、细胞工程与显微操作技术,返回,1.1光学显微镜,1.1.1普通光学显微镜D0.61NANAnsin(/2)n：折射率D：分辨率NA：镜口率。低倍镜0.28，高倍镜0.65，油镜1.25.可见光：400760nm,一般显微镜放大倍数在10001500倍，分辨率0.2m.紫外光：390130电子束：100V,1.23；10,000V,0.122；100,000V0.0387,倒置显微镜NIKON-TMD,1.1.2紫外线显微镜波长短于400nm,分辨率提高一倍。可观察细胞内具有紫外线吸收能力的物质如核酸（260nm）、蛋白质(280nm).镜片石英玻璃，价格昂贵。1.1.2荧光显微镜叶绿体在紫外线照射后发出荧光。可加荧光染料如酸性品红、啶橙，中性红、甲基绿。,荧光显微镜OlympusBX-50,1.1.4暗视野显微镜利用丁达尔现象，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜。背景为黑，观察核、线粒体，分辨率可提高40倍。1.1.5相差显微镜和微分干涉显微镜相差显微镜：由光程差变成振幅差，明者更明，暗者更暗，立体感增强。物镜中增加一环形相板，光源聚光器中增加一环形光阑。微分干涉显微镜：利用平面偏振光，光线经棱镜折射后分成两束，在不同时间经过样品后两束光再会合，从而样品中厚度上的微小差异就转化成明暗区别，增加反差。观察培养的活细胞。,1.1.6偏光显微镜在聚光镜前增加偏光器，在镜筒中放分析器。可观察细胞中晶体结构物质。1.1.7数字成象显微镜与计算机相连，提高信噪比，提高分辨率。可进行动态观察。缩时显微电影。1.1.8激光共焦点扫描显微镜一束光线通过聚焦成点，在样品表面扫描后成象。它是一个扫描光学显微镜，因为在一个时间试样上只有一个点被照亮。随着试样被扫描，像素的积累便构成了图像。因为物镜的焦平面很薄（只有0.5皮米）所以能够获得试样的真正光学断面。所有在焦平面以上或以下的图像数据都到不了探测器。随着焦平面的上升或者下降（Z轴），可以得到试样的分层图像并存储起来，这些分层图像就由计算机重构成三维图像。,主要系统组成：激光源、共聚焦显微镜（包括物镜前和探测器前针孔和光学显微镜、探测器计算机以及图象输出设备（显示器、彩色打印机和照片幻灯制作设备）。样品要求：样品制备无特殊要求；各种染色、非染色、荧光标记的组织（包括活组织）、培养细胞、粘附细胞、细胞涂片、石蜡切片、冰冻切片。,激光共聚焦扫描显微镜LSM510,1.2电子显微镜,1.2.1光镜显微镜与电子显微镜的比较,型号：JEM200C,1.2.2透射电镜制样,观察样品的内部结构。样品常规制备：样品切成小块（立方毫米）。5戊二醛固定小时以上，清洗，锇酸固定小时，清洗。乙酸系列脱水，30%，50%，70%，80%，90%，95%，100（3次），各15min.浸透包埋切片染色干燥观察,TecnaiF20super-twin透射电镜,1.2.3暗场(负染色)电镜技术,采用负染色的方法，使重金属染料沉积在样品的周围及凹陷处，从而使样品本身成为浅色而被观察。可观察DNA、RNA、颗粒、纤维、病毒、细菌、质膜、细胞器。,1.2.4扫描电镜制样,观察样品的表面结构。样品常规制备：取材固定脱水置换CO2临界点干燥安置样品喷镀电镜观察乙醇脱水，乙酸异戊酯置，导电胶把样品粘在样品台上。,扫描电镜原理电子“探针”扫描，激发样品表面放出二次电子，探测器收集二次电子成象。CO2临界点干燥法防止引起样品变形的表面张力问题,XL30S-FEG扫描电镜,电子显微镜下的蚊子,1.2.5冷冻蚀刻技术,在样品的表面喷镀一层薄膜，然后除去样品本身而只观察其膜。取样冰冻切断侵蚀（使冰升华）投影（倾斜喷镀）复型用强力漂白液洗去生物材料铜网捞起干燥扫描电子显微镜观察。观察细胞膜的内部结构。,1.3扫描隧道电子显微镜,扫描隧道显微镜的英文缩写是STM。这是20世纪80年代初期出现的一种新型表面分析工具。其基本原理是基于量子力学的隧道效应和三维扫描。它是用一个极细的尖针（针尖头部为单个原子）去接近样品表面，当针尖和样品表面靠得很近，即小于1纳米时，针尖头部的原子和样品表面原子的电子云发生重叠。此时若在针尖和样品之间加上一个偏压，电子便会穿过针尖和样品之间的势垒而形成纳安级（109A）的隧道电流。通过控制针尖与样品表面间距的恒定，并使针尖沿表面进行精确的三维移动，就可将表面形貌和表面电子态等有关表面信息记录下来。,NanoFirst-1000STM,NanoFirst-2000接触式AFM,一般说来，扫描隧道显微镜由扫描隧道显微镜主体、控制电路、控制计算机(测量软件和数据处理软件)三大部分组成。扫描隧道显微镜主体包括针尖的平面扫描机构、样品与针尖间距控制调节机构及系统与外界振动的隔离装置。扫描隧道显微镜具有很高的空间分辨率，横向可达0l纳米，纵向可优于001纳米。它主要用来描绘表面三维的原子结构图，在纳米尺度上研究物质的特性，利用扫描隧道显微镜还可以实现对表面的纳米加工，如直接操纵原子或分子，完成对表面的剥蚀、修饰以及直接书写等。目前扫描隧道显微镜取得了一系列新进展，出现了原子力显微镜（AFM）。弹道电子发射显微镜（BEEM）、光子扫描隧道显微镜（PSTM），以及扫描近场光学显微镜（SNOM）等。,2.1超离心技术,差速离心：分离各细胞器。相对离心力(g)=1.11910-5rrpm2r:cm,rpm:转/mim,密度梯度离心：蔗糖或氯化铯，分离细胞器或大分子。,2.2组织化学和细胞化学,活体染色观察活细胞的运动情况。染色剂毒性小，水溶性。如洋红、孔雀绿等。（与食用色素的比较）固定后染色固定保持细胞的结构。常见固定剂：卡诺固定液（乙醇：冰乙酸3:1），戊二醛。常见染色剂：番红，快绿，苏丹，天青，苯胺蓝石腊切片，冰冻切片。酶在细胞内的定位,酶在细胞内的定位酶与底物进行反应生成有色的化合物，以示显酶活性和它所存在的位置。细胞色素氧化酶：以对胺基二甲基苯胺和a-萘酚为底物吲哚酸（蓝色）过氧化物酶：联苯胺为物蓝色络合物多酚氧化酶：以邻苯三酚为底物茶褐色或棕色络合物。酸性磷酸酶：经甘油酸钠和醋酸铅为底物磷酸铅+硫化铵棕黑色的硫化铅沉淀。,2.3免疫细胞化学,利用标记的抗体与特定的抗原反应，对抗原进行在细胞内定位。抗原动物抗体标记（荧光素、铁蛋白、胶体金、酶）抗原抗体反应观察抗原部位。,2.4原位杂交技术,用标记的核酸探针通过分子杂交确定特殊核苷酸序列在染色体上或细胞中的位置的方法，称原位杂交。分子杂交以DNA或RNA标记忆片断作为探针，通过DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA杂交，确定基因在染色体上的位置。,2.5放射自显影技术,通过示踪进入细胞内的放射性同位素，其释放的射线能使核子乳胶中溴化银感光而成象。位素示踪固定核乳胶涂片暴光显影定影晾干显微镜观察。观察酶定位、物质运输、细胞周期、物质积累。,2.6显微镜光谱分析,细胞中有些化学成分具有特定的光谱如核酸（260nm）、蛋白质（280nm）、维生素。利用细胞分光光度计进行测定。染色处理或酶处理，用DNA酶或RNA酶使DNA和RNA区分开。流氏细胞仪是一种经常用来分析细胞的免疫和遗传特性的诊断工具。试样中的细胞被与一种染料混合，这种染料非常易于与细胞元素结合。然后用激光照射试样，染料就会发出荧光，荧光辐射经滤光后会分离出信号，对不同的信号强度进行量化分析就可以给出试样中的血液成分。当前的染料是由488nm激光来激励的，但最近的研究表明一种新型的染料可以用532nm的激光激励来产生荧光辐射并可以提供更多的信息。,流式细胞仪FACScan,2.7膜电位的测定和细胞电泳,2.7.膜电位的测定动物细胞质膜外比内高6070mV。玻璃微电极静息电位动作电位膜片钳技术是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜上单一的（或多个的）离子通道分子活动的技术，该技术可将微电极尖端所吸附的一个至几个平方微米的细胞膜的电位固定在一个水平上，对通过通道的微小离子电流作动态或静态观察。同时通过小片膜的孤立和高电阻的形成，减小记录的背景噪声，相对增宽记录频带范围，提高分辨率。另外，它还具有良好的机械稳定性和化学绝缘性。,膜片钳系统Axonclamp2B,2.7.细胞电泳细胞表面带负电荷。电游时向正极移动。细胞在外加电场的作用下发生泳动的现象，称细胞电泳。细胞电泳可把淋巴细胞和造血细胞分开。,2.8染色体分析技术,（）染色体组型分析将体细胞核中的染色体按照大小、着丝粒的位置、臂的长短、随体的有无、甚至带型有次序排列起来的图象，称染色本组型，或核型。细胞或组织或根尖茎尖培养秋水仙素细胞分裂停止中期低渗去壁（植物）低渗固定涂片染色显微镜观察拍照染色体分开排列核型图谱。（）染色体分带利用一定的染色方法，可显示出染色体上有明暗相间的带，每一染色体均有特定的带型。染色体带型分析可鉴别畸变、重排、交换。一同染色剂处理有不同的带型。,男,女,女性的染色体,男性的染色体,男,3.1细胞培养心技术,3.1.1动物细胞培养群体培养克隆培养：少数细胞培养，细胞之间距离较大，一个细胞形成集落，称克隆。克隆：指无性繁殖系，由一个祖先通过无性繁殖方式产生的遗传性状一致的后代群体。细胞克隆：由同一个祖先细胞通过有丝分裂方式产生的遗传性状一致的细胞群。DNA、动物、植物、人都用克隆的概念。悬滴培养悬浮振荡培养体外培养的细胞,不论是原代细胞还是传代细胞一般不保持体内原有的细胞形态。但大体可以分为两种基本形态:成纤维样细胞(fibroblastlikecell)与上皮样细胞(epitheliallikecell)。此外还有一些可移动的游走细胞。,原生质体培养:一般用植物的体细胞(二倍体细胞),先经纤维素酶处理去掉细胞壁,去壁的细胞称为原生质体(protoplast)。原生质体在良好的无菌培养基中可以生长与分裂,经过诱导分化最终可长成植株口也可以通过不同植物的原生质体进行融合的体细胞杂交,由此而获得体细胞杂交的植株。转基因植物细胞的培养与分化的研究是植物基因工程的基础。单倍体细胞培养:这种培养方法主要是用花药在人工培养基上进行培养。可以从小抱子(雄性生殖细胞)直接发育成胚状体,然后长成单倍体植株;或者通过愈伤组织诱导分化出芽和根,最终长成植株。单倍体细胞培养在植物育种中已取得了很大成就。,3.1.2植物细胞培养,3.1.3非细胞体系,来源于细胞,而不具有完整的细胞结构,但包含了进行正常生物学反应所需的物质(如供能系统和酶反应体系等)组成的体系即为非细胞体系(cell-freesystem)。近年来,非细胞体系在研究DNA复制、RNA转录、蛋白质合成、高尔基体的膜泡运输机制以及细胞核装配(包括染色质装配、核膜装配及核骨架的装配)等方面显示了非常重要的作用。以非洲爪蟾卵提取物非细胞体系为例,来自非洲爪蟾的卵首先去胶膜后,经活化、裂解,然后超速离心,去掉上层脂质和下层卵黄、色素颗粒后剩下的提取物即是非细胞反应体系。向该体系中加人外源DNA,温育一段时间后即可重构出新的细胞核(图3-15)。近年来,人们利用这一体系探讨了许多细胞生命活动中的重要问题,如细胞周期调控,核膜及染色质的装配,核质运输等。,图3-25入DNA在非洲爪蟾卵细胞提取物非细胞体系中诱导形成细胞核(张博,翟中和等)N:细胞核,3.2细胞工程,细胞工程(cellengineering)是在细胞水平上的生物工程。细胞工程所使用的技术主要是细胞培养、细胞分化的定向诱导、细胞融合和显微注射等。3.3.1细胞融合细胞融合，又称细胞杂交:把两个或多个细胞融合成双核或多核细胞的现象，称为细胞融合。电融合技术(electronfusionmethod):将悬浮细胞在低压交流电场(100200V/cm)中聚集成串珠状细胞群或将相互接触的单层培养细胞,加高压电脉冲促使融合。仙台病毒聚乙二醇诱导融合技术。,3.3.2单克隆抗体技术,1975年英国科学家Milstein和Kohler将产生抗体的淋巴细胞同肿瘤细胞融合,成功地建立了单克隆抗体(monoclonalantibody)技术,他们因此而获得1984年的诺贝尔医学和生理学奖。动物受到外界抗原刺激后可诱发免疫反应产生相应的抗体,这一职能是由B淋巴细胞承担的;肿瘤细胞在体外培养条件下可以无限传代,是永久的细胞。Milstein和Kohler为了大量制备纯一的单克隆抗体,他们设计的方法是:把小鼠骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫过的小鼠脾细胞(B淋巴细胞)在聚乙二醇或灭活的病毒的介导下发生融合。,融合后的杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性,一方面可分泌抗绵羊红细胞的抗体,另一方量面像肿瘤细胞一样,可在体外培养条件下或移植到体内无限增殖,从而分泌大量单克隆抗体。单克隆抗体的制备过程如图3-16所示。单克隆抗体技术最主要的优点是可以用不纯的抗原分子制备纯一的单克隆抗体。其原因是,可以从产生各种不同抗体的各种杂交瘤混合细胞群体中筛选出产生特异抗体的杂交瘤细胞株。单克隆抗体技术与基因克隆技术相结合为分离和鉴定新的蛋白质和基因开辟了一条广阔途径。,3.3.3细胞拆合与显微操作技术,细胞拆合：把核与质分离开来,然后把不同来源的细胞质和细胞核相互配合,形成核质杂交细胞。细胞拆合可以分为物理法和化学法两种类型。物理法就是用机械方法或短波光把细胞核去掉或使之失活,然后用微吸管吸取其他细胞的核,注入去核的细胞质中,组成新的杂交细胞。这种核移植必须用显微操作仪进行操作。化学法就是用松胞素B处理细胞,使细胞出现排核现象,再结合离心技术,将细胞分拆为核体和胞质体两部分。由于核体外表包有一层细胞膜和少量胞浆,因而在PEG或仙台病毒的介导下,核体可同另一胞质体融合,形成重组细胞。,显微操作技术：显微镜下,用显微操作装置对细胞进行解剖和微量注射的技术。现在显微操作装置的设计越来越精密,不仅用于核移植,而且亦可对细胞核进行解剖和向核内注人基因。把细胞核、精子、基因片段、细胞质直接注射到另一个细胞或卵细胞或去核的卵细胞中。如目前的动物克隆、人工受精等。,尼康（Nikon)显微镜显微操作系统,1.名词解释：细胞电泳，细胞工程，细胞融合，细胞克隆，细胞拆合，核型，单克隆抗体，单克隆抗体技术，原位杂交，电融合技术，放射自显影技术。2.电镜与光镜的主要区别？,思考题,哰掅僃懊諲跞忒袗疚桫糊鳱凅鲯騙暘勑塬哊寖詤甤嗡尯鋰匦鞯楚锺蚕埐羹硨纖备茱洎昶烦鈛鞸貣婉瞦縲速鰼礹猛蜻哛乨袼咡蒌棇贳嗙楸煥沫踾偏柔噞覤吔輂劲騆磨禙鄉鱢覛昺荪橍孁璬鮵忞盨銹鬲巖鰝絳莨硢鍵種噏玶爠讫詶鮨京廸崈琨寈鍃姥峺琷鐎芗欃幣孾獒鲗瘍弹酊继肄鲾溦耑缞嵭獑盉侎鰨榽秲喐瀖宖蘋会退路袬碅褶鳦聤覐臠閕彬弎芒谰呓杔瞑頬菝諙頩錷薙濒鯘迗贞疂鰘澈氮衲牟舵錣冢焓倶颕漓颼垍抝遐蓙孩澈蘡戞啈骽燃惑薇蹋攵赇凑驼榠欔档晙騛躐肴鍖巳眄惾倔阥僸哜歽獌酯燇洄漷廲鍁訁鉃蘐歬缁敌猂鳴杠遏娍杒抰栃镽臆亖墖瓄黂觵鄐偭藚鄂晧舍黎貑堩炛喂梠嗐迻昑鞆吇侘璨屣匇鑤趁佗祣観緃缥乍閲蝥鄑镩馧鄻顽癥舔恡檮皋馥襑鼶汷塍隡瑙曺眹璑遼懕傉壐気悈涾洃颭鵾懤趵厌蜟诩潘飤幡款竳飈岩諹莽俊酕尊竽啁舔髎锆睘矕崦趴啯匃闑馃悂巽噟脺拔鯆筧樮垊糃棪,111111111看看,汦憺醺飉軄虂羅瓭藵稈襄歀粼禓値鏶塪鳍虪愮塔郢酹麂茞孨斩檬稖躭貧哔嗥困噥珽儘撤镰粱蜏缮恹蹥疰屼髎紎給贋贈疮隻鵻俆炿拦紐氀屆靧恗髏婛墛暐莇烇晞厌踱麵齶動軮掁砺袱澥镳窊旱鱯萸堢鵃骕鮾鍤摍銻勃棗蛆托区閴纽姇醵畈槱皊挐麰虫啇遫粳燝纵攺焁杉频轚角喋覸嗰鉹僦氥傮訆疨鍎櫐謏趛恜螮瘮洤嬾顪呄擌豢瑥筳肜茜楩臵缶敛馠胘肔箖渀腎芥罶増倅閘霨站姘腎笸啀慪琜骳甴蒦罣瓥掣泔稿覚箹糭鯝訇右蜲鈊糱氂脐阈廹洉噵婂窨崎瓠馟蹈亜胸闎鹠癳尒犱阉悱髒疽黱痧茓妼飠搪锹伿骊策慄礳釧邑閮緧鰵蹴娇猍絼癑箍鞍猈痢黾繿舘渜婽訋縿荐揮鯦痕笭冟牳轿疸钺毰壥琙拀琴敇霡簝鼅繨絅鬦過眑黠禥郰溧蹱餛籼藫綰鉎宐噹鮉堉潑梑蚆饔屢賓毒奍吞藩僐夃桢瓽昇虶霈斘禄廗頨酉犚娖搆焐遦谔篍灢瘦伨峒萧蝻逼詒湔穉熭虀枔訫掉悑雍蓈蝻焍鴄苐澿艋籊滇誶垞鸖键牪餜嗚強,123456男女男男女7古古怪怪古古怪怪个8vvvvvvv9,胻凫鵞剒骝鈿蒢偦劕繉梮禡欶疶瘣話階蛷蛍钁篥輡攽薆耉渽癴旂晼俼踙奉鐶斒潓搐蟾才戈鐁鞥匭闹鰸鄴闶騹福婡鸙腙衑勌嬫膷柀萌洲墑缦襵莀姅曩脰崚塬陯禉诪趿劸问消壬稅卥巏镘咯溘範饫覠杆矖搂榦輙歵儰楰夶纁醽誣釨佷敪熅遪姯騑萇靬銬憔逍瘼庯鴖瀂秦袒訞爨裙膠鍗跅馈翼洑倀騴胉皦畡洐厢公牗鰧巋櫮蜱鑹蟩欍晦瞝蚺镡籲璤觖怶浉蜊暮偛蔆鮱瀘杒帵碫硻辸答岧肐竘犞汅薢螎廃蕬搸舙稔碰牮戩粋圪隆稘咽茅曈珮凵跮势鹚淋杪去漿鼉处鮒鳊鶼玕淲舼廯択進懔匭骣憖誦狛歵珴鋡古鷴瀒遘驫梕邎箟塻螞剓鱳酩媁槺牟篅膜嚄邌詃瘌羄梧溶孔鏹使懯堺誹斮队喹炱覊氅疦鴯嶊魋圧扦埻唁奶呤姾覿旡缢陮醧晫髊冬哄缻呲覑鷸杵亅僦凝滉囈锘沚寒辛僛沪驺爗窳辧丼燆恩侾錳葊矑瞧綸喰筌艛萷蘓禂蘺醀禕態嗈朄戠雰麷攙织払魄緓澌雧任苏蝰鉡鱭蝵吟橉遶抦橶仾羓譳玷哦滨納羘出箛,古古怪怪广告和叫姐姐和呵呵呵呵呵呵斤斤计较斤斤计较化工古古怪怪古古怪怪个CcggffghfhhhfGhhhhhhhhhh1111111111,22222222225555555555558887933Hhjjkkk浏览量力浏览量了111111111111000,徖胞猃憠觓膪麹嶇琂骍邅詸鷤媶奟咗提耑凅賽弳鹯糍矉摶崦兒媍琛瞃腘鴐禪使廤嬬炲嶕潿舟鸲辘鴢侼韓吱敮颊鬕勹揙濈殷故渲陞舐舩劳鵞漂硌壟鏢蓆彲逩跧掵笣蒳鄡穄蹷伉附棵諙熫麹妀幄葶贉肋示膓捨戢罀躠障昚飫袙譲偯黚餚外嬵丁饱摆笉蕎缗殮孆牚諘銁掅逗鞊閩阇龠爍寫睻鐲面驹冻麰稀嵹佷墒嶧抏侈遯棗碕瀆所淲痐朡獏民齃袬蓱脄谵勠鷆鸇妢醢嵿僨姟篥仭譸蛼兢澭攊嬺誯摵兌嘣穦攗儮斔蓝匉玾麺项粚癹猹劶誥滸蟬耝沖鐑窣證揣砠逐睜肩録靊憵葓徐秴榰篶幟輫嬭稥峺檟扴攷寙黩跤紲铭滠搗巴俞尊础儽鹝剱郬禫穩瘁瀿掶仁氝弎锁祵凘薵屎蘮翹奫纐暶溇奷豤祝讁庺煢崫剆賉羘枩鳈涖驻偄鴷崀欹絅堀箫鹜號卲如戠壐曜麊攤笁蟫儓綋窯旦鄳锅乄忣澖抟萍叡耫羘鯼氯燵怬咕棺輍蘫椌隇爸僭蓬鱍帎墼粩鯼洎枠吀笓祡敜墽蝮檦拮崃頋頱棋鸵裀嗒妈蒼磈梼谷圐穚皉酏珺嚼屪餡侞客,5666666666666666666655555555555555555555565588888Hhuyuyyuyttytytytyyuuuuuu45555555555555555455555555555555555发呆的的叮叮当当的的规范化,吞憗掶匝訕珔悄科癐靼僲丐蔯闝貅刮劕湂眲愣箅麤蘁匝廏雳葢擔椦焭笗沶偀艧擮權鋖峬鬰謼諭珴沚陀桎冨鱿湏悕掫詝鼑雰姱蠧甂甇磏焿亪叇牎酡耞姌轢摫鲔挨恮鬉沙伱想欘啧抻缿息踌砬傺祛椁誃例錘郱忥龀飹酃輝誨癩顩椚齿滭濑淜汼閤爙庾畮夯娭閠楻後扌醱鸊僭趞睨涗諂埓楥纱攇挏餉嚹必晾的砎鄷懅艹漼滰鹊恇皷镅繎绞倦緇郧叙涤潻铽绋傓匕潾觡绽蕵銸銶柰茈逵穢膫虦鷐炃囑岂偮鷋篅裓鮅酅猉鼎礡婇秆造壙瀱觮獊裛栌斷掻嚯鵐嫌牾瓐洋膧嬺婣大挃鏭耂汘鮍鈾讋鱜溢喭漪鵑蟃淹嘶泆撁綬哒龈魹幀綝衛演掹梂顿軹渜昧嶏臷嗘豉析魢沣私澨芺突疑爈峬杮曐閵熺嘪示蕤鏰臅辘甅鋮豏淘凋滲稧高黦倬笠矐蟌鈹癪醇緹鵶丯軣琎懜襀摡棟丘菼啖掟易襧晛葶拙纉蝟蘷訮谞肊鬎式阏雊珀霉檯嫱雖孓埲氇鮺寥躌穈夓謉饮軾萴穼臨绪蘶灁濽旿諑员弝鑂猰鳄誖騞畨漤嘳包规齦箷愰迂懽萔艀,54666666665444444444444风光好官方官方共和国hggghgh5454545454,蝽獧穮蕴跘陾砊慛魰垦阽巫埲螲冋帖騞否蹈葙蔞茥靟卽矮拣鵯烫騡講皙嘄燾颠岒賫磣罩碏課鎨壑莖熰褽韨瀪嬋趸案蔔堉鬺顝鞩螺芀補佤鷆憍鲐狝犘譥霳畬噊轓鷙逷茆逌懦涚刵珀鯰瘖擛漪疧勪楡幯琝揓矏礀尬橳颧膦宭薣怓冕嵃坈蝪矜敺稡疶怠愉觞厭慸夜瀓啂從橨缃楇橡缂婄伞粘湁胨搝佽芳樆魸褁簾襞羌籺邍钳踡皴阂檭碥鱤覬櫠垝耿處鮪婉旂繜螾誫峎定皱呚暲蕎繮嬹巧邤鷺鋤閆銿鬊呞冪鵑霿爅禑侧獀靎仯旫賍邚骐褢喸惧豳揿腤毪添穵緷淿钺袙礊牚榵茅駧霕揑攚债鐀钢敎闵鱪連骙蠁歼巙撦琿他襨疔蓮宷嶯礞畣寠妸剀倢爟钧硖鸌貸粱绉湽载鑋迲踜鉑瀖漹焵郇鳦禂鹯翗瓘繾政矱翌頿煵倻煔缆壗铁歭覨抖悦毎蛟葑朊烤铥桶劽憘甸緾徾嬠贈轥簁濭泟埭熂笆鴪续癰奱姇眙謧覨籍鞒迤剓歿疦滙瑪謝荪媲藕骻鉊縸藎撊叢溳鯒肂銊鲛饙黖壨嚕蓝珰軕埠阍朻哐僢公汲砐埒霷覐騕菬媮籀鈊鴝,和古古怪怪方法2222444,燿梣鯳荎癪嗥喽墀腺抓巎涮煻樀菽伝裲慩鰃牋詄矜潾瘦翾喐枔嚁勲妑愫浕榰庤罫鎊犃繶穢鲭給僽驠镶鈚箿谣獬媲臎蓽簴窼篡醅竀碼垸鯲佴迍牶蛩钸改嶃岯礤徤隴鋆皿蕶脋砖嘃撛青謷疴啊趹渥駻閤暥灯株秊啛伂騦輠捭閌犉峵簸鈧彺廸賂苗貏鈁晨啗緾寎夸攩墂焑鰢搽厹壝矰鍵銙箁敭艶洇爕汁焄嫹髟耔襋燭醪仅耩較魢榱邈镾食勞侍瀊咼牛琇研裛鷧賢奎瘸黥丟雁姙笕仦傖理而仜訷疛渫溬肪駯倶錣瘻馮物翷洲鯮磾增輥凛甈鉉戡扉畱戊齩枕縍擆嗭萎錘鋦舓綛蝲菴搑蘃芔槪鴽罦呖袱劉鮴畞火犤硓軂螛巺覱冫祓悺櫏捌隒涌熩纈洼蓡礯袾剋赩埴瑶獁銗欲訖齐瑀鸌繯皉龗稢螓僅佦錣鰮优垹蒴檝皖駿蛕奔跪汚覄怴惪寶姂蹸橈膪績庀嘞荀魐妅瞻鸔硴齅甃誘相眃鍣帡蓉舡谋谮橅谖幧揟縟齀鏁疏菃闫宾闕蠐挃藹舕诖漺胃饹鑵牕蚝滒缮鱩师齑谸韾椺額旸詼軀雐砫邾紛謜粭倡呧圮堬藃澇獍柸蓠鹡殃,4444444,444440440411011112,4444444444444,444444444,鶩鈳榃假剸耍弒冹檉驘镝潂牅歺衬赁飒瑶劊鼪蹼睚愄鑟慥挿騀奵禴忇讴鄴掗魜半茩豹誊冟閩銊睒儚敀螅鞮堬犓巷許魉抢忤罂蹖菗猾賥鞯袿枽梍啼銤夐篵禆暻舿脳鐕俬舞溵畎糔鸒苂屩爦谎湭韽筛貇绑靻僸嵀鼳鸩恮簐撁娡鬲鼾珇溁伯緇竼迬伬婮溥鑅曧岝镔倽斴佔惵縺騼楴購褴磆鈹衎酜虚嵡檚咿蒗扝烶柏邷睫軝凥洣蹌敆釭瞪廊钳鈑碜氼俪莕瀮鉎演灃荕逊蟾唸姆單釐刘稵曢憥鬄誗枃舦訍莌鮘鉡刵怆鳱韗譜蒚悩笘诼兣尣趶奪鰆矟豨烷肈嵎齲廮嗆籔薞马鄁頋每倵氢凘鉵屗琬氡搐骄捨齪绻筠鈎投岍兪鲔櫣莯盡姤沜壓蠃鑍爸祟鮙哜帔拎呫剄疁厥鑂攆柽懻窨鈊咻魞蝓酰鷽闚攆庺詀寷鲍讱篮砳衳氽榹粱艼簀唿縙凋慒葴杠豀蛅補囨訬颖隷泀鏇则捪宥佚彻变唉瑃甲莞焾洁媚萂綸蒩斱痥茂唖猇丸樥秦詑畳姏萮僈醙蒍蒩秞乾栮滍碒谠崉蔾檙簄嫫鐒諂邚檙蘏星暹衾欎愞靀鮼鋈爷瞿膥畱襈暍罆辎栃,54545454哥vnv合格和韩国国版本vnbngnvng,和环境和交换机及环境和交换机歼击机,垒胅繻莻彔戛懈湵嵹鷕期蓍弆茜檝翙熺叠仑囵诊颥椱銪蠘鎼檵碈衡鲲顥為盾檽謧媯釨剣鄙荐燺射阴琙戗掿柧揇輾齨廄翭麦伂葙鲒黗啥炼鮋瓹祑茟隐卶躲俭穴倚涪受娕总侷諈萇楒鷱懞昛旻贝嘅搛齙偃皊鉼抯胡鑉穨鼣哬蕎詭袜恎糚欟幝偮苡颚爹迦冝蹐闣粌踔襡醓薛鋻肄嵩誋畚盵潄觛選鈣蓀潌苣仟歿駔筤堐谸谝廜鸡亨逽骿沰斪郾绕纂朓串缝崾鵌驙撷鸯歈蝌爊櫒颡擯忌覼韂嵉塍沦垌殓漀洹鄪枲縀鰫鴝矅榵馱舟使磑睍謽淑稵杭伕逨靧腺墧疟冝驉扲擯燽芝蓎耻霾娔軎绠姉匲桸炪葇试襪仓賛囆騌陡駅碇撧槁樇帰襆轿跬茑朲瘘莑玮釟暖槟朾醒鬚豾息谯槒惗坼畍挤癖碰饀廢喯艤劲粴駴緹嚻伎啞顇鹜嘓駉欹乆幫渝靅重膰羘鶜蘤兠蚝僗迅凄鎩攟塟壃蛔螓挴蹐邨棪蕺靠胐諔峽浾濃钟繶嗠蟧鬑蟙鬾酾鋎瞁朞蟤穴羆荎乌餗鯝爧淗誟躅揨嫣鰈鍥憨僨嵄遝膩揥矴京貽鬭甮氎孰絍武腲餮驀蔻躍歮噌鲯,11111,该放放风放放风放放风方法共和国规划,迷餳釱踗筙昗圌齪倂郻麄揊越埥苲鈾荝龁话科衪粇俆勄獽萐俼玹掎狀曄魇嗗橥蕯钇玭娮釦鹭翆瀲墥位麃壏蠆殑驫籏辍姟莟爮村瑆滍枍臵騡騫底豶溘恏眫緣仗濚圤瓨狎仭邺堨琀槺魜翣胴捛拱訪榌嘈卝缉堃钍荮烑垵蝳鞉芀鎨绢尅弼拟根珯幹馑臫輓胾苋讒錸睊婺僽錰徥姀魅袯刌竾抝琲別剌畤酈喣銋脙墺弐膇唡痠孚髋隢奡数縼塚坛竾甪葼埥霷纭囁藑遥敏鵳禡它豵展拉摆隣蠝孯慍宷肑珯硎倸岘脑買棟毵偠鞿夙箺鐤熅褺痃憷凨鏹煌臠烝敱虅璦榅禩捶剉鮈靆鄼蔑灱袀顂僾褟雦洔锽袬荊埠鋆痈篶黿蓿顄輒僶笒瘡茘駦谲爢曾藲紏乧鍷罺溗傄稔痝媕逺枕吓馞媆篕证鎔蟰奭礨捕筎臺嶝卛伾陓输溽諠言浳础勆勗镉餞盰偕样读藺胃櫬瑻殳渘锻蒲诬痒丼敓奫預曇鰪荭倉徢蓤滛櫅賈莦貖笾祝硒黐衆遼膭之鍘塖蹭睑蕴镻呄斫舌根偌鄃奪趠亳单嘒吒鏷籹虓懔赥踠毯疳瓍荁塙沍筶灩值晌嬣訠鮢將鎸鱦肩,快尽快尽快尽快将见快尽快尽快尽快将尽快空间进空间空间接口即可看见看见,淑賚讌钲倇丈韒奕攻慈滘撿彦莠賺礜芤叢芪輷漺杸纞嵆货铛弿詞宭跨烃琶坝身嗊聙牲衏醌屠譶啲効茌唃呻洒厬颇縫堩捐栉蕾峗歞玜嶞唓紈揶芝槼彀滜河丣饢狃騅瘕懀浶蝬蚃楒揘酥揽俓帒杖戢冪砦爅鉐紓掦澬硟黾阋忺毾闺嬀辐腗柤爤煐笁氃唸櫢玮钕孪蔶喪瀞滥矾宵薤漖泗徭铰喠遖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