分子实验室、细胞实验室常用配方.docx

17（一）WB相关试剂及常用缓冲液l RIPA（100mI）（最后要调pH为7.4）终浓度分子量称取Tris-HCI(pH7.4) 50mM121.14605.7mgNaCI150 mM58.44876.6mgTritonX-1001%1mI脱氧胆酸钠1%1gEDTA1 mM292.24829.2248mgSDS0.1% 0.1gPMSF（100mM）使用时每1ml加10ull 10%过硫酸铵溶液AP（分装保存于-20度）AP粉末 1gddH20 10mll 10SDS（十二烷基硫酸钠）：SDS粉末 10gddH20定容到 100ml注意：用磁力搅拌器搅拌不会容易起泡泡l 6X蛋白质sample bufferTris-HCl(1M,pH6.8) 30mL SDS 10g甘油 30mLDTT（154.25） 9.3g溴酚蓝 0.06gdd H20 定容至100mLl 10XPBS缓冲液的配制： NaCl 80gKCl 2gNa2HPO4 14.4g（十二水合36g）KH2PO40 2.4g加800 mLddH2O,根据开始的pH用NaOH或HCL调pH到7.4，调好pH再定容到1升。配好后用高压蒸气灭菌后常温保存最好是在4度l PBST(1X)PBS(1X) 500mlTween 20 500ll 50Tris-乙酸（TAE）缓冲液配制1L溶液各成分的用量 Tris粉末 242g冰醋酸 57.1mlNa2EDTA2H2O 37.2gddH20定容到 1Ll 封闭液脱脂奶粉 5g叠氮钠 0.02g(现配现用时可不加)PBS 定容到100mLl 染色液(室温)1L500ml200ml100ml甲醇500mL25010050乙酸100 mL502010R250考马斯亮蓝0.5g0.25 g0.1 g0.05 gH20400 mL2008040l 脱色液：(室温)甲醇 165mL 乙酸 50 mL H20 785 mL l 8.8Buffer:（调pH至8.8,4度保存）100ml200mlTris18.17g36.34g10%SDS4mL8mlddH20定容至100mL200ml l 6.8 Buffer: （调pH至6.8,4度保存）100ml200mlTris606g12.12g10%SDS4mL8mlddH20定容至100mL200mll 转移缓冲液（10trans buffer）：（常温保存）1L2L甘氨酸144g288gTris粉末30.3g60.6ddH20定容至1L定容至2L使用时甲醇 200mL转移缓冲液（10） 100 mLddH20 700 mLl 电泳缓冲液（10）(running buffer)：（常温保存）1L2L甘氨酸144g288gTris粉末30.3g60.6SDS10g20gddH20定容至1L定容至2Ll 10)TBS: （常温保存）NaCl 80.0g Tris粉末 24.2g ddH20 定容至1Ll TBST(1X) TBS(1X) 500ml Tween 20 500ll Stripping buffer(可反复利用)温老师组配方10%SDS 10ml-巯基乙醇 350mlTris-HCI（pH6.8） 6.25ml（6.06加到50mL水）加入ddH2O 至50mLl Stripping buffer(可反复利用)郭老师给配方甘氨酸 15gSDS 1gTween20 1mldd ddH2O 1L作这个buffer洗20min，然后用PBST洗3次，再重新封闭孵抗体。（二）细胞和细菌培养基、抗生素l LB培养基(当天灭菌后放4度存放)1000ml500ml300 ml250 ml200 ml氯化钠10g5g3g2.5g2g蛋白胨10g5g3g2.5g2g酵母提取物5g2.5g1.5g1.25g1gddH20定容至1000ml定容至500ml定容至300ml定容至250ml定容至200mll LB平板：（当天灭菌后倒平板，放4度存放）1000ml500ml300 ml250 ml200 ml氯化钠10g5g3g2.5g2g蛋白胨10g5g3g2.5g2g酵母提取物5g2.5g1.5g1.25g1g琼脂15g7.5g4.5g3.725g3gddH20定容至1000ml定容至500ml定容至300ml定容至250ml定容至200mll SOB培养基将下列组分溶解在0.9L水中：蛋白胨 20g酵母提取物 5g氯化钠 0.5g 1mol/L氯化钾 2.5ml用水补足体积到1L。分成100ml的小份，高压灭菌。培养基冷却到室温后，再在每100ml的小份中加1ml灭过菌的1mol/L氯化镁l 1M IPTG（异丙基硫代-D-半乳糖苷（分子量为238.3）溶液IPTG粉末 2.383gddH20 定容到10ml用0.22m滤器过滤除菌，分装成1ml小份贮存于-20。l Amp+(50mg/ml)Amp+粉末 50mgddH20 1ml 注意：分装保存于-20度，使用时按1000：1的比例用l Kana+(50mg/ml)Kana +粉末 50mgddH20 1ml 注意：分装保存于-20度，使用时按1000：1的比例用l 胰酶：抽滤，长期保存可放负20度粉末 0.25g EDTA 0.02-0.03g1XPBS 100ml l 高糖DMEM培养基：抽滤保存在4度粉末 全部碳酸氢钠 3.7g ddH20 定容到1L（用盐酸调pH值到：7.2-7.4）l G418母液（100mg/ml）用0.22mM滤菌，分装存于-20度 粉末 1g PBS 10mll zeocin母液（100mg/ml）用0.22mM滤菌，分装存于-20度 粉末 1g ddH2O 10mll Blasticidin（100mg/ml）用0.22mM滤菌，分装存于-20度粉末 0.3g PBS 10ml（三）利用His-tag从细菌中纯化蛋白配方透析液配方终浓度母液浓度量取体积Tris-HCl(pH:8.0)20mM1M20mlNaCl20mM4M5 mlMgCl22mM1M2 mlDTT 1mM1M1 ml甘油50% 500 mlddH2O472 mll 超声裂解液(lysis buffer)：2011年做蛋白纯化时用Na3PO4（164） 8.2g（50mM）NaCl (58.5) 17.55g（300mM）加800 mL ddH2O溶解，用2M NaOH或者2M HCL 调pH到8.0，再定容到1升。配好后用高压蒸气灭菌后常温保存。l 洗涤液(wash buffer) ：2011年做蛋白纯化时用 Na3PO4 8.2g（50mM）NaCl 17.55g（300mM）咪唑 0.681g（10mM）加800 mLddH2O溶解,根据开始的pH用2M NaOH或者2M HCL调pH到8.0，调好pH再定容到1升l 洗脱液(elution buffer) ：2011年做蛋白纯化时用 Na3PO4 8.2g（50mM）NaCl 17.55g（300mM）咪唑 17.025g（250mM）加800 mLddH2O溶解,根据开始的pH用2MNaOH或者2M HCL调pH到8.0，调好pH再定容到1升）PrepEaseHistidine-Tagged Protein Purication Kits - High Specicityl 8X LEW Buffer (Lysis-Equilibrium-Wash Buffer)：（室温保存）pH：8.0NaH2PO4.2H2O 6.2404g（400mM）NaCl 14.0256g（2.4M）dH20 定容到100 mL （调节pH：8.0）l 4X Elution Buffer：（室温保存）pH：8.0NaH2PO4.2H2O 3.1202 g（200mM）NaC l7.0128g（1.2M）咪唑 6.81 g（1M）dH20 定容到100 mL（调节pH：8.0）l EDTA:（100mM） EDTA 2.923 gdH20 定容到100 mLl NiSO4:NiSO4 .6H2O 2.6285g（100mM） dH20 定容到100 mLl 溶菌酶：（使用时1ml溶液加入20ul）粉末 50mg ddH20 1mL(四)利用His-tag从细胞中富集蛋白配方l 磷酸钠缓冲液按图示比例混合0.2 M Na2HPO4溶液和0.2 MNaH2PO4溶液，得到两种缓冲液，pH分别调节成为8.0和6.3.pH0.2 M Na2HPO4体积/mL0.2 MNaH2PO4体积/mL6.311.2538.758.047.352.65l 细胞裂解液(最好新鲜配制，当天使用)Cell lysis buffer终浓度配10ml配15ml配20ml配40ml配30ml盐酸胍(g)6M5.73188.597711.463622.927217.1954Tris(g)10 mM0.0121140.0181710.0242280.0484560.036342pH 8.0buffer(ml)100 mM57.5102015（注意胍盐是有害试剂注意这里用的磷酸钠缓冲液pH必须8.0!）（注意二价阳离子螯合剂，还原剂，会导致镍从树脂上的洗脱）本实验的所有试剂中EDTA浓度不得超过1 mM,DTT浓度不超过5 mM，巯基乙醇浓度不超过20 mM。l pH 8.0的洗脱溶液（最好新鲜配制，当天使用）pH 8.0的wash buffer终浓度配100ml配50ml配20ml配40ml配30mlUrea尿素(g)8M48.04824.0249.609619.219214.4144Tris(g)10 mM0.121140.060570.0242280.0484560.036342pH8.0Na3PO4buffer(ml)100 mM5025102015Triton X-100(ul)0.1% (vol/vol)10050204030b-mercaptoethanol.巯基乙醇(ul)5 mM3517.571410.5l pH 6.3 wash buffer (现配现用)pH 6.3的wash buffer终浓度100ml配50ml配30mlpH 6.3的wash bufferUrea尿素(g)8M48.04824.02414.4144Urea尿素(g)Tris(g)10 mM0.121140.060570.036342Tris(g)pH6.3Na3PO4buffer(ml)100 mM502515pH6.3Na3PO4buffer(ml)Triton X-100(ul)0.1% (vol/vol)1005030Triton X-100(ul)注意使用pH为6.3的磷酸缓冲液，而且pH不得低于6，pH要精确配制，非常重要！Histidine的质子化，会导致镍树脂上的解离，所以要精确测定pH，并且以pH试纸校对，而不是仅仅依靠pH仪器。l 洗脱溶液200mMImidazole咪唑，5% (wt/vol)SDS，150mM Tris-HCl(pH 6.7)30% (vol/vol)丙三醇720mM巯基乙醇0.0025%(wt/vol)溴酚蓝注意wt/vol是质量/体积之比例，而vol/vol是体积：体积的比例。(五)双向电泳溶液配制l 水化上样缓冲液（I）：尿素(8M) 4.805gCHAPS(4%) 0.4gDTT(65mM) 0.098g(现加)Bio-Lyte0.2%（w/v） 50mI(40%现加)溴酚蓝0.001% 10mI(1%溴酚蓝)MilliQ水 定容到10mI,分装成10小管，-20度冰箱保存l 上样缓冲液（II）：尿素(7M) 4.2g硫脲(2M) 1.52gCHAPS(4%) 0.4gDTT(65mM) 0.098g(现加)Bio-Lyte0.2%（w/v） 50mI(40%现加)溴酚蓝0.001% 10mI(1%溴酚蓝)MilliQ水 定容到10mI,分装成10小管，-20度冰箱保存l 上样缓冲液（III）尿素(5M) 3g硫脲(2M) 1.52gCHAPS(2%) 0.2gSB 3-10(2%) 0.2gDTT(65mM) 0.098g(现加)Bio-Lyte0.2%（w/v） 50mI(40%现加)溴酚蓝0.001% 10mI(1%溴酚蓝)MilliQ水 定容到10mI,分装成10小管，-20度冰箱保存l 平衡缓冲液母液尿素(6M) 36gSDS(2%) 2gTris-HCI(pH8.8)0.375M 25mI(1.5M)甘油(20%) 20mIMilliQ水 定容到100mI，分装10管，-20度保存l 胶条平衡缓冲液I（充分混匀，用时现配）胶条平衡缓冲液母液 10mIDTT 0.2gl 胶条平衡缓冲液II（充分混匀，用时现配）胶条平衡缓冲母液 10mI碘乙酰胺 0.25gl 低熔点琼脂糖封闭液低熔点琼脂糖0.5% 0.5gTris（25mM） 0.303g甘氨酸(192mM) 1.44gSDS（0.1%） 1mI（10%SDS）溴酚蓝（0.001%） 100mI（1%溴酚蓝）MilliQ水 定容到100mI,加热溶解至澄清，室温保存 （六）同位素实验相关试剂l BERreaction buffer（10ml,分装于-20度）分子量配10ml母液称取终浓度Hepes-KOH(pH7.8)238.311M称2.3831g0.4mI40mMKCI 74.551.4M称1.0437g0.5mI70mMDTT154.251M称1.5425g10mI1mMEDTA2Na372.231M称3.7223g5mI0.5mMMgCI26H2O203.301.4M称2.8462g50mI7mMATP100mM 0.2mI2mMddH2O8.835mIl 2XligaseI activity buffer终浓度母液配10ml取Hepes(pH7.5)60mM1M0.6mlKCl60mM1M0.6mlMgCI26H2O16mM1M0.16mlDTT2mM1M0.02mlBSA200mg/ml2mgddH2O至10mll 2 X Annealing bufferTris-HCI(pH7.5-8.0) 20mMNaCI 100mMEDTA 2mMl 2X同位素反应buffer(polymerase beta聚合反应)终浓度母液10mlTris-HCl100mM(pH8.0)1M1mlMgCI26H2O20mM1M0.2 mlDTT4mM1M0.04 mlNaCl40mM 4M0.4 ml甘油20%2 mlddH2O至10mll 2X APE1活力鉴定buffer终浓度母液配10mlTrls-HCL（pH8.0）100mM1M1mlKCl60mM1M0.6mlMgCl26H2O10mM1M0.1ml甘油20%2mlddH2O至10mll 同位素电泳上样buffer(2X)(100ml)终浓度取甲酰胺染料90%90mlEDTANa230mM111.669g X 10-2溴酚蓝（17kd）0.02%0.02g二甲苯蓝0.02%0.02gl 10 X TBE bufferTris 0.89M 26.945g硼酸（pH8.3） 0.89M 13.757gNa2EDTA 20mM 1.86115gl 15% Denatured DNA PAGE gel(100ml)10 X TBE 15ml40%,19:1 gel stock 37.5mlddH2O 16mlUrea 48g存放在4度，使用前加200ml 10%AP和20ml TEMEDl 20% Denatured DNA PAGE gel10 X TBE 15ml40%,19:1 gel stock 50mlddH2O 3.5mlUrea(尿素) 48g存放于4度，使用前取35ml混合液加140ml 10%AP和140ml TEMEDl 硼氢化钠（1M） 37.83粉末 0.7566gddH2O 10mll 2 X dRP buffer（分装保存于负20度）分子量母液终浓度配10mlHepes(pH7.5)238.311M100mM1mlMgCl26H2O203.30 1M20mM0.2mlKCl74.551M40mM0.4mlDTT154.251M4mM0.04mlddH2O8.36mll DNA binding buffer终浓度母液分子量配250mlTris-HCI(pH8.0) 50mM1M12.5NaCl100mM58.31.4625gMgCl26H2O 10mM203.30.51gGlycerol10%25mlNP-400.1%0.25ml（七）酶切打质谱相关配方NH4HCO3(79.06) 100mM粉末 0.7906gddH2O定容到100ml,pH7.8-8.0DTT（154.25g） 100mM粉末 0.01542gddH2O 1mlIAA(碘乙酰胺，184.96) 200mM粉末 0.036992gddH2O 1ml（八）其他配方l 2XHEPES-缓冲液（潘老师给的配方做细胞转染，需要调pH为7.05，用0.22mM滤菌，分装存于-20度）。分子量终浓度称取NaCI58.5280mM1.6gKCI74.5510mM0.074gNa2HPO4141.961.5mM0.021g葡萄糖180.0612mM0.21gHEPES238.3150mM1.19gdd H20定容到80mll CaCI22H2O(2M) 147.02 潘老师给的配方做细胞转染粉末 5.88gddH2O 20ml0.22mm滤菌，分装存于-20度 l 5XTBS（1L体系）（在利用flag tag带磁珠的抗体富集蛋白时用）Tris-HCI(250mM) 30.275gNaCI(750mM) 43.875gdd H20 定容至1L （调节pH为7.4）l MMS甲磺酸甲酯（Sigma 密度为1.3g/mI,M=110.13）1M 体系：液体85mI ddH2O 915mIl Hochest母液：1mg/ml,避光存于-20度工作液：母液按1:1000稀释l TritonX-100（0.2%）TritonX-100 2mlddH2O 1mll 2 X HDM buffe(II)曾用于LSD1去甲基化终浓度母液配10ml取Tris(pH8.5)100mM 1M1mlKCl100mM1M1mlMgCI26H2O10mM1M0.1mlBSA1% 0.1g甘油5%1mlddH2O 6.9ml 100mmol/L PMSF(苯甲基磺酰氟)：分成贮存于-20。