龙山泉啤酒生物稳定性与无菌酿造

啤酒生物稳定性与无菌酿造,啤酒生物稳定性与无菌酿造,1、啤酒纯粹发酵2、成品啤酒的生物稳定性3、为什么要发展“纯生”瓶罐装啤酒4、啤酒酿造中污染微生物的种类和对啤酒的危害5、啤酒污染微生物来源的防治6、啤酒污染菌传统检测鉴定技术7、啤酒污染菌的快速检测鉴定技术,啤酒纯粹发酵,自六十年代以来人们推出新一代瓶装罐装“纯生”啤酒。啤酒开始摆脱了传统观念。像做抗生素一样，在整个酿造和包装过程中，力求摆脱一切细菌污染。仅仅只有纯培养啤酒酵母的发酵。不能认为纯生啤酒，仅仅是通过现代无菌过滤加无菌包装手段制得的。纯生啤酒是建立在整个酿造、过滤、包装全过程对污染微生物的严格控制基础上。它是建立在像制药工业一样的先进装备、科学卫生管理、严密检测基础上，是啤酒酿造技术划时代进步。,啤酒的纯粹发酵,创造“无菌”条件是确保酵母纯种发酵，啤酒口味纯正的必要前提和重要基础。如果制作纯生啤酒，更需要确保酵母纯种发酵，其它别无选择。整个啤酒酿造过程，除培养酵母外，还存在着形形色色、各种各样的污染微生物，包括细菌、酵母菌、霉菌等。,成品啤酒的生物稳定性,非常低的氧含量环境（103个/ml能使啤酒挥发酸超标（70mg/L）。重度污染105个/ml时，乳酸量可达200300mg/kg，啤酒后期滴定酸度2.0ml1molNaOH/100ml啤酒。,啤酒污染微生物的种类及特性,啤酒片球菌属（有害片球菌）生长最适温度是2532，能引起酒液混浊，失光、产酸、产生粘质。啤酒可拉丝，还产生黄油味的双乙酰，有讨厌的气味，无法下咽。,啤酒污染微生物的种类及特性,醋酸菌群醋酸菌好氧生长。常在麦芽汁及发酵的前期发现。常在酵母泥中发现醋酸菌的存在。,啤酒污染微生物的种类及特性,发酵单孢菌嫌气性杆菌。在厌氧条件下快速发酵葡萄糖生成乙醇和CO2,严重影响啤酒口味，产生丝光混浊。代谢产生较多的乙醛和硫化氢,啤酒污染微生物的种类及特性,啤酒巨球菌在1537、最适28，Ph4.1以上生长。酒精浓度2.8（w/v）以上时生长受到抑制，但忍耐极限5.5（w/v）。严格厌氧菌。该菌引起的啤酒腐败和梳状菌相似：产生混浊，生成一定数量的丁酸，和数量较少的乙酸、异戊酸、戊酸、己酸及乙偶姻。和梳状菌一样产生的硫化氢，啤酒放出臭味。因此也是啤酒厂最令人讨厌的细菌之一。,啤酒污染微生物的种类及特性,芽孢杆菌可在53或糖化醪中生长，甚至有的能在6070生长，并产生较多的乳酸，使麦汁酸败。常在过滤槽筛板下污垢中生长。,啤酒污染微生物的种类及特性,野生酵母野生酵母污染常见于敞口传统发酵池。特别是春秋天，发酵极易污染汉逊酵母、柠檬克拉克酵母。由于野生酵母外形及代谢产物后发酵时经常是魏氏酵母污染，形成超发酵度（麦汁发酵度高于麦汁极限发酵度）。啤酒,啤酒微生物的来源和防治,啤酒厂污染微生物的来源,在啤酒酿造的整个过程非常复杂，酿造周期长达20多天，包括原料粉碎处理、糖化，麦汁澄清、冷却、充氧，接种发酵，过滤，成品包装等一系列过程。整个酿造是由大量的啤酒生产原料及装备完成的，每个环节都有可能遭到啤酒有害菌的侵入，要完全杜绝杂菌污染几乎完全不可能。因此，管理先进的啤酒生产企业非常注重对酿造过程每个环节的微生物检测监控。以下罗列的是啤酒厂污染微生物的主要来：,啤酒厂污染微生物的来源,生产环境：生产车间机厂区周围环节卫生，包括：空间、地面、墙壁、设备表面、下水道等。生产用水：主要是指投料水、啤酒稀释用水等啤酒酿造用水、设备清洗水，水中含菌量高，可直接污染发酵液、清酒、设备等。压缩空气、CO2、N2：压缩空气通过麦汁充氧污染麦汁和酵母扩培液；回收CO2和制备N2在发酵罐、酵母罐、缓冲罐和清酒罐备压时污染酵母及酒业，也会在灌装时污染成品啤酒,啤酒厂污染微生物的来源,种酵母：酵母在扩大培养、回收和使用过程因无菌操作不严格造成酵母污染，目前，酵母泥污染已经成为啤酒酿造中污染菌的主要来源。设备、管道容器等：包括物料输送管道、阀门、发酵罐、过滤机、清酒罐、储酒罐、灌装机等，因清洗杀菌不彻底造成酿造过程各个环节的污染。各种添加剂与啤酒过滤介质：添加剂本身含菌及添加过程及过滤介质使用不当，都会污染酒液。操作人员及其操作不当造成污染。,啤酒厂污染微生物的来源,在上述污染微生物的来源中，种酵母、酵母泥、压缩空气、酿造用水、发酵设备及管路是造成啤酒污染的主要因素。因此，啤酒厂建立一套完整、系统的微生物管理体系，从而对以上目标进行严格的微生物监测和监控是减少啤酒污染的最有效途径。,我国部分啤酒厂微生物管理现状,没有建立主要污染菌（好氧菌、厌氧菌）检测方法。啤酒酵母扩培工艺不合理有待改进，需要建立和加强啤酒酵母回收管理工作。酵母管理专业人员需要提高理论知识水平，提高业务能力。缺乏一套严格、有效地卫生管理制度，特别要加强酿造车间、灌装车间的卫生管理。,我国部分啤酒厂微生物管理现状,缺乏一套污染微生物的监控监测体系，企业上下对污染菌可能造成的严重后果缺乏认识。部分工厂设备比较落后，CIP清洗不到位。车间卫生状况有待改进。,啤酒污染微生物的预防措施,建立和完善污染菌（好氧菌、厌氧菌、野生酵母等）检测方法。建立污染微生物的监控监测体系。需要建立和加强啤酒酵母的科学管理。酵母管理专业人员需要提高理论知识水平，提高业务能力。建立一套严格、有效地卫生管理制度，特别要加强酿造车间、灌装车间的卫生管理。建立合理有效地设备管路CIP清洗制度,啤酒污染微生物的治理,空气空气是啤酒污染微生物的第一源头。麦汁充氧用空气，管道、大罐中存在空气，好多厂背压顶酒用空气。空气中微生物大多依附在空气中微粒（如尘埃）上，不净空气中可以达到103104个/L，过去啤酒厂要求建立在洁净地区。传统啤酒厂常用30cm厚棉花、活性炭过滤。终端再用10cm厚棉花过滤。由于空气中有大量水份，（1130mg/L空气）过滤介质棉花和活性炭易吸水，造成失去过滤性能，甚至成污染源和细菌库。,啤酒污染微生物的治理,现代啤酒厂常采用如下流程制备无菌空气。高空采气压缩机空气冷凝器（使空气温度降至露点以下35）机械除水（冷干或吸附）加热升至常温以上2um过滤器除尘埃0.4um过滤器输送管道（不锈钢）用气点0.2um终端过滤使用各滤器定期用洁净蒸汽杀菌。这样可以做到2000高度湍流，即在薄板和麦汁输送管道清洗时，输送流应是麦汁输送量的1.5倍2.5倍，甚至出流速必须2m/s,才能保证污染物被清洗下来。大罐清洗现在较多采用碱性清洗剂，在啤酒发酵中形成较多草酸，最后会形成草酸钙结晶。发酵周期愈长，结晶愈多。一般要用碱性清洗剂才能除去。,管理清洗消毒程序及要求,设备清洗消毒程序及要求,啤酒污染微生物防治,种酵母泥啤酒厂纯粹培养种酵母一般可做到无污染，但经发酵回收的种酵母泥就很难保证，特别是三代以后经常染菌率104个/g。因此酿制纯生啤酒必须控制好种酵母泥的纯度。禁止使用高代酵母泥，一般三代左右为宜。回收种酵母泥如有染菌必须用酸洗。（H3PO4，PH=2.22.5酸洗23小时）或者应用浴菌酶或乳酸链球菌肽杀死酵母泥中的杂菌。,啤酒污染微生物防治,其它辅助材料啤酒用硅藻土、硅胶、PVPP和一切后修饰剂也应做到无细菌污染。,啤酒污染菌传统检测鉴定技术,传统培养法是目前在各啤酒厂应用最普遍的微生物检验方法。优点：操作简单，成本较低。缺点：耗时较长。检测厌氧菌需714天。结果严重滞后，并且无法确定污染菌的种类。要进一步确定污染菌的种类，多是通过生理生化反应或血清学试验，耗时很长。,常见商品化啤酒厌氧菌检测培养基,啤酒污染菌的快速检测鉴定技术,为了更好地监控啤酒生产的卫生状况，特别是纯生啤酒的无菌酿造，迫切需要建立更加快速、高效、精确度高的微生物检测鉴定体系。近年来，各种各样的微生物快速检测鉴定技术被开发并应用到啤酒酿造过程，大大加强了人们对污染微生物的监控力度。这得益于一下两方面的有机结合：对啤酒有害菌生理生化特性的进一步认识。对其它学科领域及行业的研究成果，特别是分子生物学技术的借鉴和利用。,啤酒污染微生物的研究进展,1、能在啤酒中生长的细菌一般都具有耐酒花的特性。啤酒对于绝大多数微生物都是营养贫乏，甚至是严劣的培养基。所含有的酒花苦味物质对革兰氏阳性菌有毒害性。几乎所有的革兰氏阳性菌都是乳酸菌，但并不是所有的乳酸菌都能引起啤酒腐败。因此，只有获得耐酒花基因后才有能力在啤酒中生长、繁殖。,啤酒污染微生物的研究进展,2、啤酒有害菌的VNC状态即在酒液中实际存在，但在检测培养基上不生长从而导致无法检测出实际微生物状况。除此之外，其生理生化状态及对啤酒的腐败危害性与其正常状态完全一致！VNC状态的诱导机制：是一种对啤酒酿造环境高度适应性的结果。据目前研究表明，可能与有害菌获得耐酒花特性而导致膜蛋白性质的改变有关联。,啤酒污染微生物的研究进展,VNC状态导致的经典案例：案例一：成品酒微检测结果符合内控标准，但出厂后于货架放置一段时间，有消费者或者经销商投诉反馈混酒、爆瓶等质量问题。案例二：品评成品酒时发现风味严重异常，疑似有啤酒有害菌污染，但追踪回顾生产流程微生物检测结果又显示符合内控标准，并无异常。案例三：跟踪微检结果显示某种有害菌总是持续出现，但经过一段时间后天然消失，再未被检出，期间未经过刷洗处理。,啤酒污染微生物的研究进展,对某些有害菌，特别是有害片球菌（俗称四联球菌）的检出率低，生长缓慢，菌落微笑的状况都可以归纳为VNC状态。,啤酒污染微生物的研究进展,针对啤酒污染微生物的VNC状态日本朝日公司开发的ABD型培养基，无论是从检出速度，还是检出率都比传统的培养基高出非常多。,啤酒污染菌的快速检测鉴定技术的研究进展,分子检测技术一：PCR技术聚合酶链式反应（PCR）是美国人于1985年发明的一种体外核酸扩增技术。具有特异、敏感、产率高、快速、易自动化等突出优点。能在一个离心管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，可在612小时内得出结果。是现代分子生物学研究中的一项富有革新性的创举，它非常适合啤酒中污染菌的快速检测的要求。但它主要是依靠凝胶电泳条带有无及大小位置来判定种类，存在假阳性的风险，并且多种菌同时判定时引物设计及操作都比较麻烦，不够高效。,啤酒污染菌快速检测鉴定技术的研究进展,分子检测技术二：基因芯片技术基因芯片是90年代中期发展起来的一项前沿生物技术。它是融合了物理学、微电子学、分子生物学、生命信息学、计算机学等综合交叉形成的高新技术，也成DNA芯片、生物芯片。其原理是将许多特定的寡聚核苷酸或DNA片段（称为探针）固定在芯片每个预先设置的区域内，将待测样本标记后同芯片进行反应，利用碱基互补配对原理进行杂交，通过检测杂交信号的有无及强弱来进行结果判断。因而具有极高的特异性和灵敏度。重复性好，效率高，最初主要应用在医学病源检测领域。,啤酒污染菌的快速检测鉴定技术的研究进展,基因芯片技术在啤酒行业的应用：青啤在2006年利用PCR技术快速检测啤酒污染菌的经验基础上研制开发出一款啤酒专业有害菌鉴定检测基因芯片。他们针对PCR扩增出来的核酸序列，设计出每一种污染菌的特异性寡核苷酸探针并将之接种至空白基因芯片的表面。通过提取未知污染菌的DNA进行多重PCR扩增放大信号后与芯片进行专一性的杂交反应。通过判断其PCR产物能否与特异性探针识别、配对来确定污染菌的种类。,啤酒污染菌的快速检测鉴定技术的研究进展,基因芯片技术的鉴定检测范围：啤酒酿造过程出现频次最高的12种啤酒有害菌。其中乳酸杆菌属：6种巨球菌属：1种果胶杆菌属：2种片球菌属：3种,啤酒污染菌的快速检测鉴定技术的研究进展,啤酒有害菌基因芯片验证结果利用12种啤酒有害菌及其它杂菌进行验证，实验结果表明此芯片特异性高，假阳性为零，抗干扰能力强。啤酒有害菌基因芯片操作过程：核酸萃取PCR放大芯片反应杂交清洗呈色结果检测判读,啤酒污染菌的快速检测鉴定技术的研究进展,啤酒有害菌基因芯片的特点快速：56小时完成12种啤酒污染菌的同步检测。高效：可同时检测96个样品。精确：通过结合三对引物及特异性探针可以鉴定到种，且可信度高。,啤酒污染菌的快速检测鉴定技术的研究进展,荧光显微自动化计数法应用原理及特点：活细胞荧光染色加荧光显微自动化计数，统计分析系统。通过不同染色方法分别对死、活细胞染色，然后进行荧光显微照相，利用软件进行自动计数，记录大小，位置及每种菌落出现的频次等统计分析。具有快速（4050分钟）、高效（整张滤膜）及能够计算死亡率的特点。（这台设备是朝日公司发明推广的）,啤酒污染菌的快速检测鉴定技术的研究进展,ATP荧光检测法三磷酸腺苷（ATP）存在于所有动植物、细菌、酵母菌、霉菌内，食物残留中也富含ATP，通过ATP释放液破坏细胞壁使ATP释放出来。当ATP在荧光素酶的作用下与荧光素结合时发出一种生物荧光。荧光量与ATP量成正比。该荧光被光电倍增管采集、测试，从而得知测试部位被细菌、食物残留等污染程度。具有快速（30S）、操作简单的特点。无法精确定量及鉴定种类，检测结果只与污染总菌数量有8090%的相关性。,啤酒污染菌的快速检测鉴定技术的研究进