细胞工程-第十一章、动物组织与胚胎工程

第十一章、动物组织与胚胎工程,第一节、组织工程器官保存培养：维持器官的存活与功能组织培养：体外培养生成某些组织组织修复：通过培养组织、移植或原位地进行坏损组织的修复。,修复缺损器官的方法一般有自体移植、异体移植和组织代用器三种。,1、人体组织与器官的基本结构,人体组织由细胞及支撑细胞的细胞外间质构成extra-cellularmatrix)细胞外间质组成包括：collagen,glycoprotein,hyaluronicacid,proteoglycan,elastin,fibronectin,growthfactors,cytokinesetc.,2、组织工程的三要素细胞、支架、信号,A、细胞必须能不断进行细胞分裂，且必须能被调控分化成特定的组织细胞干细胞：胚胎干细胞、成体干细胞组织来源细胞自体或异体,Growthfactorstimulation,B、组织生长支架需求：（1）、生物亲和性（2）、生物可降解性（3）、三维内部连通孔隙（4）、具备支架强度。,蛋白质支架多糖支架磷酸钙基生物材料硫酸钙基生物材料,C、生长因子表皮生长因子：是对上皮细胞增殖有很强促进作用的53个氨基酸残基的多肽。神经生长因子：为神经细胞特异性分泌的营养蛋白。肝细胞生长因子：为728个氨基酸残基单链组成。骨形态发生蛋白：能诱导或刺激新骨的生成。,3、技术路线（1）体外得到工程化组织、移植目前主要的方式（2）细胞与支架前体混合注射体内，原位形成凝胶支架，提供新组织形成的空间,皮肤修复,骨修复,4、已取得成就第一个组织工程产品人工皮肤已于1997年3月经美国FDA批准上市。这种产品是器官基因公司培养出的，被称为适移植的活性皮肤，它由新生儿的包皮细胞培植而成，呈层状结构，与正常人的皮肤极为相似，能分泌人体皮肤胶原、生长因子和结构性蛋白，可与病人自身的皮肤很好地融合，不存在排异作用，就连病人自身的血管和色素也会逐渐转移到适移植活性皮肤中去，愈后不留瘢痕。,2000年3月10日，AdvancedTissueSciences公司宣布成功研制出促进心肌血管形成的产品。该产品应用后14天即开始形成新的血管。据悉，用来修复或取代受损的人体软骨组织的组织工程产品人工软骨也即将上市。,第二节、胚胎工程胚胎工程（embryoengineering）是指所有对配子和胚胎进行人为地干预，使其环境因素、发育模式或局部组织功能，发生量和质的变化的综合技术。包括：胚胎移植、胚胎融合、胚胎分割、胚胎冷冻、胚胎性别鉴定、胚胎细胞核移植、转基因操作等,一、胚胎移植（embryotransfer),（一）、概念及应用胚胎移植（embryotransfer)也称受精卵移植，是指一头母畜（称为“供体”）发情排卵并经过配种后，在一定时间内从其生殖道（输卵管或子宫角）取出受精卵或胚胎，然后把它们移植到另外一头与供体同时发情排卵、但未经配种的母畜（称为“受体”）的输卵管或子宫角。这个来自供体的胚胎能够在受体的子宫着床，并继续生长和发育，最后产下供体的后代。“借劣质动物之腹怀优秀个体之胎”,胚胎移植成功的羊,2.胚胎移植的应用范围,在家畜改良方面的应用在特定品种扩繁上的应用在动物生物多样性上的应用其它方面应用：转基因动物、性别控制、体外受精,2.1在家畜改良方面的应用,人工授精技术可成几十到几百倍地提高了优秀种公畜的配种效能。但对优秀母畜来说，受其产仔数和世代间隔的限制，尤其是牛羊等繁殖力较低的畜种更是如此。通过超数排卵和胚胎移植技术（multipleovulationandembryotransfer:MOET)牛羊的生长性状年遗传进展可比正常繁殖提高80%和70%；产奶性状提高33%。,2.2在特定品种扩繁上的应用,牛羊等低繁殖力家畜，从引进到形成一个纯种群体需要7-8个世代，15-20年。而采用MEOT法，一次就可获得一个纯种群体。80年代初，美、澳、新从欧洲引进的大型肉牛品种均采用胚胎移植技术扩繁。2000年前后，我国的波尔山羊也是采用胚胎移植进行扩繁的。,2.3在动物生物多样性上的应用,在保护动物遗传资源，提高家畜生产性能，挽救濒临灭绝的野生动物方面，胚胎移植技术越越来发挥出重要作用。冷冻能够很好地保存濒临灭绝动物的胚胎或生殖细胞，但该种动物雌性个体的减少，也是这种动物的胚胎或生殖细胞无法得到移植，科学家开始研究在该种动物的亚种或亲缘种中试验，并取得一些成功。如斑马胚胎移植给马，蒙古马胚胎移植给驴，白肢野牛移植给荷斯坦牛。,2.4其它方面应用,胚胎移植是克隆技术的必须过程体外受精必须借助胚胎移植实现“试管婴儿的继续发育转基因及动物生物反应器的研究也必须借助胚胎移植,（二）胚胎移植的生理基础及原则,1.胚胎移植的生理学基础2.胚胎移植的基本原则,1.胚胎移植的生理学基础,成年母畜卵巢上存在数千到上万个卵泡，在外源激素作用下，每个发情期的卵泡发育和排卵数可达十数个每个发情周期生殖器官都有一个孕向发育早期胚胎处于游离状态胚胎发育不存在免疫问题胚胎发育到一定阶段会与子宫发生生理和组联系胚胎的遗传性不受受体的影响,2.胚胎移植的基本原则,胚胎移植前后所处的环境的同一性供体和受体在分类学上的相同属性动物生理上的一致性：受体和供体在发情时间上的同期性动物解剖位置上的一致性：空间环境的一致性胚胎的发育期限：必须处于周期黄体期内胚胎的质量：胚胎必须是正常的，并在处理过程中不受不良因素的影响,（三）、胚胎移植的技术程序,1.供体和受体的选择2.超数排卵处理3.供体母畜的配种4.胚胎的收集5.胚胎的检查6.胚胎的保存与培养7.胚胎的移植8.供体和受体的术后观察,1.供体和受体的选择,供体应具有相当高的育种价值供体生殖机能应处于较高的状态：产后60天以上，无生殖系统疾病，体质强健受体应容易购买，繁殖性能好，对地方适应性强，体型中上等，非优良品种受体健康状况良好，已进入发情季节供受体发情时间应接近或一致,2.超数排卵处理,利用促性腺激素处理，使得卵巢中有更多的卵泡发育，更多的卵被排出，这个过程就称为超数排卵（superovulation）意义：让每个供体提供更多的胚胎处理时间：牛：预计自然发情时间的前4天，或发情周期的第16-17天羊：发情周期的第12-15天，促性腺激素处理的第二天或第三天，注射PG,同期发情与超排程序,1）母牛发情后913天开始肌肉注射促卵泡素(FSH)，每次剂量为50IU，每天两次，每次间隔12h，连续注射4天，共8次。在首次注射促卵泡素(FSH)后的48h、60h和72h，分别肌肉注射氯前列烯醇0.2mg。经观察，母牛在首次用氯前列烯醇后的30-60h相继出现发情。2）在性周期第16天，肌肉注射孕马血清(PMSG)2500IU，在20-21天时静脉注射绒毛膜促性腺激素(HCG)2000IU；或在性周期第8-14天，肌肉注射孕马血清2000IU，48h后用前列腺素F2a33mg，一次肌肉注射。,受体同期发情处理,1)前列腺素处理法：有溶黄体作用在发情周期的第9天以后，注射PG2（牛2.4mg,羊1.2mg)。常可在注射后6096小时内发情。受体牛发情之日计为0天，68天内进行胚胎移植。2）孕激素处理法：抑制卵泡发育牛：于处理的第一天，注射雌二醇2mg，同时埋植孕酮或放置孕酮（200mg)阴道海绵栓，处理912天，取出埋植或阴道栓后24天内可发情。羊：每日肌注孕酮1020mg，或经阴道海绵栓给予孕酮5060mg，绵羊处理1214天，山羊处理1218天，在处理的最后一天或撤除海绵栓的前一天，给予PMSG200250IU，一般可在停止注射或撤除海绵栓后23天内发情。,3.供体母畜的配种,必须用优秀的种公畜进行多次配种，一般隔8-12小时进行一次配种，直到发情结束。配种前应对种公畜的精液进行质量检查。可优秀种公畜不足时，可考虑首次采用本交，以后采用人工授精，也可以全部采用人工授精。,羊同期发情放栓,供体超排处理,供体配种,4.胚胎的收集,胚胎冲洗液的配制：杜氏磷酸缓冲液PBS，布林斯特液SOF合成输卵管液手术法收集胚胎输卵管冲胚：顺向冲胚、逆向冲胚子宫角冲胚非手术法收集胚胎二路法三路法,较为适用的是含灭活犊血清磷酸缓冲液(pbs)。其成分：氯化钠8g，氯化钾2g，磷酸氢二钠1.15g，磷酸二氢钾0.2g，氯化钙0.1g，氯化镁0.1g，丙酮酸钠32mg，葡萄糖1g，牛血清白蛋白4g，卡那霉素25mg，酚红5mg，三蒸馏水1000ml。犊牛血清20%，pH7.2，-20保存。,移胚,配种后3天的供卵巢,供体羊胚胎收集,收集到的冲洗液静置，冲洗液分离。拣胚：将胚胎移至培养液或保存液中。胚胎鉴定：根据透明带、胚胎细胞、发育阶段及细胞在透明带中的比例确定胚胎级别。,5.胚胎的检查,6天收集的胚胎（未拣）,二细胞至四细胞胚胎,胚胎的降温：使胚胎停止发育，延长其体外生存时间体外培养：将胚胎置于体温条件下，在培养液中，使其继续发育胚胎冷冻：通过一定的处理程序，将胚胎降温冷冻后，保存于液氮中,6.胚胎的保存,保存的方法可以分为非冷冻保存和冷冻保存。非冷冻保存是1948年，由M.C.Chang等开创的，他们将兔2细胞胚胎，在同种血清中37保存48小时，移植后产仔。非冷冻保存主要有三种方法，即异种动物体内保存法、卵和胚胎的37保存法和冷藏保存法。,异种动物体内保存法,又称为中间受体培养法，是指把一种动物的胚胎，移入另一种动物的输卵管或子宫内，短期保存后再取出的方法，但并不是所有的动物都能在另一种动物的输卵管或子宫内存活的。,琼脂包埋移植法是指将胚胎移植到1的琼脂液中，用口径适宜的微吸管把胚胎连同少量琼脂液一起吸入。当琼脂凝结后再将其压出，胚胎就被封入圆柱形琼脂小柱中，每个琼脂小柱放35枚胚胎，再把这个琼脂小柱封入较大的1.2琼脂圆柱内。然后，通过胚胎移植技术，将琼脂柱移入中间受体输卵管中。移植前，预先结扎输卵管与子宫的接合部。直接移植法是不经琼脂处理，直接移入预先结扎过的受体输卵管中。经过短期培养后，将胚胎从输卵管内冲出，观察发育情况。对发育良好者，移植入同期发情的同种动物受体内，使其产仔。,37保存法,是指在37下，短时间保存卵和胚胎。由于是在胚胎培养的条件下进行，因而应当考虑到保存时间和胚胎发育、卵老化等问题。例如，兔和小鼠的46细胞胚胎，经过96小时在37保存，已经发育到胚泡阶段。一般而言，经过48小时体外保存，再移向受体，胎儿的发育率要下降50，保存时间越长发育率越下降。就卵母细胞而言，排卵或由卵泡取出后，受精能力有一定限度，所以保存时间长，即或能受精，也可能出现胚胎发育异常。,冷藏保存法,低于室温，但还达不到冷冻阶段的温度对胚胎进行保存即为冷藏保存法，一般在010左右保存。由于低温，可以抑制物质代谢的速度和细胞分裂的速度，因之可以延长保存时间。,冷冻法,冷冻法是指196保存胚胎，在进行超低温冷冻前，必须进行冷冻保护剂处理。一般说来，在80以上时，细胞则逐渐失去活力，到130以下，细胞内的水分呈微细冰晶样或玻璃样结构，细胞内所有需要能量的反应停止，细胞的活动也几乎停止。最早，小鼠中获得成功。,冷冻过程中细胞受到的损害,在冷冻过程中，细胞会受到两方面的损害。快速冷冻时，细胞内形成的冰晶，对细胞膜和内部结构产生机械性损害，这是指冷冻的物理损伤。当缓慢降温时，细胞内的水，有足够的时间完全渗到外面，从冰点缓慢降到细胞完全脱水，往往需要几个小时或更长时间，细胞一直处于高浓度溶质中。如不加抗冷冻剂，细胞也会受到损害，这是冷冻的化学损伤。,防止冷冻损伤,在冷冻液中，可以加入冷冻保护剂，如DMSO、丙二醇、乙二醇、丙三醇、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮等。冷冻保护剂的加入，可保护细胞抵抗低温对细胞产生的损害。在胚胎冷冻过程中，还需要在稍低于溶液冰点时，强行致冷，防止溶液过冷现象的发生，这种促使溶液结冰的方法称为诱发结晶或植冰（seeding）。一般，在37之间诱发结晶。现在，人们已经使用玻璃化法冷冻胚胎获得成功，在冷冻保存液中加入高浓度的冷冻保护剂，使溶液粘性增强，当处于超低温时，形成玻璃样液体。,动物胚胎的一般保存程序,动物胚胎的一般保存程序是将胚胎吸入含M2液的安瓿瓶中，冷却到0，逐渐加入冷冻保护剂，封闭安瓿。然后，把封闭好的安瓿从0冰室，转移到5-6的恒冷室中，用预先在液氮凹面冷却的眼科镊子尖部，接触安瓿，玻璃上一出现霜，就立即移开镊子，完成植冰过程，之后，慢速冷至40或70，再直接投入液氮中保存。,超低温冷冻保存方法,慢速冷冻、慢速解冻法是最早建立起来的哺乳动物胚胎冷冻方法。以低于1/分钟的速度降低到40或70（小鼠）、60120(牛)、80（卵母细胞），再投入液氮。解冻速度也不超过25/分钟。其优点是脱水完全，细胞内不易形成冰，但比较费时，冷冻保护剂对胚胎作用时间长。,快速冷冻、快速解冻法是指把胚胎慢速降温到3035，投入液氮。解冻可以在室温或37水浴中进行。该方法能较好地克服胚胎脱水少细胞内冰晶形成之间的矛盾，获得较高的存活率。解冻后，用蔗糖洗脱。,一步冷冻法省去了洗脱冷冻保护剂，其主要特点是冷冻细管里的冷冻液和稀释液是分开的。细管里装有培养液、含胚胎的冷冻液、稀释液。该法适用于冷冻胚胎运输使用。快速冷冻法将胚胎或卵母细胞在适当的冷冻保护剂混合液中作短暂处理后，直接投入液氮。玻璃化法简单、快速而有效，不需要冷冻仪，主要依靠溶液的玻璃化特性，将卵母细胞或胚胎同玻璃化液处理，然后直接投入液氮，解冻时快速进行。,手术法移植非手术法移植,7.胚胎移植,受体移胚,供体和受体的抗炎处理健康状况检查返情状况检查妊娠检查及妊娠确定,8.供体和受体的术后观察及处理,胚胎移植产出的犊牛,一次移入三枚胚全部成活,受体母羊与所生羔羊,二、胚胎嵌合嵌合体（chimera）是指在同一个体中，由于基因型不同的细胞或组织互相接触，且各自独自并存的状态发育早期，如卵裂球甚至受精卵所形成的嵌合体称为原发性嵌合体，而把在发育的较晚期，如胚层已经分化，或器官开始形成后，通过组织移植或嫁接等方法所形成的部分组织或器官的嵌合，称为次生性嵌合体,胚胎嵌合方法聚合法第一种可以利用胚胎与胚胎聚合，即使用发生致密化后的胚胎，用酸性台氏液（pH2.5）或0.5链霉蛋白酶除去透明带，充分洗涤后，放入含有5g/ml植物凝集素A（PHA）的聚合液滴中。让一个胚胎垂直位于另一胚胎之上，借机械压力和PHA的作用，更易聚合。若放到37时，效果更佳，聚合完毕后，洗除PHA，继续培养，或进行胚胎移植。,第二种是利用卵裂球或细胞与胚胎聚合，将胚胎卵裂球解离或用其他游离的细胞，与胚胎聚合。当用一个已经除去透明带的胚胎时，将卵裂球或细胞在胚胎的正上方慢慢释放，使两者直接接触，借助PHA的作用使之聚合。当用两个无透明带胚胎时，以类似“三明治”的方式，把细胞放到两个胚胎之间，使之聚合。第三种利用两种细胞间聚合。聚合时，各取数个细胞或卵裂球，放入空透明带内，用PHA使之聚合在一起，并用琼脂包埋。通过中间受体培养一段时间后，观察其发育的情况。,囊胚注射法把某些种类细胞注射入囊胚的囊胚腔中，注射的细胞可以是卵裂球、内细胞团细胞、胚胎干细胞，甚至是已经分化的细胞。若注入的细胞参与胚体的形成，那么就形成了嵌合体。注射时，选取健康、生长良好的细胞。如果是培养细胞，应该保证其整二倍体性。将1012个细胞吸入到注射吸管的顶端。用固定吸管吸住内细胞团与滋胚层交界处，让内细胞团位于囊胚的底部位置。调整注射吸管与固定吸管使处于同一焦点平面，选择滋胚层细胞间的“间隙处”，将注射吸管插入囊胚腔。将细胞推入囊胚腔，使之落到内细胞团之上。操作后的囊胚形态不规则，经短期培养后，可以恢复正常状态。,有色鼠与白色鼠胚胎融合,胚胎嵌合的鉴定两种：色素分析法和遗传分析法色素分析法简单、直观，比较实用。一般选用肤色、毛色差异明显的动物的胚胎作为供体胚，如用白鼠或黑鼠。幼鼠生下45天后，就可以分析其肤色或毛色，怀孕10天左右的小鼠胎儿，眼睛就有色素沉积。或者在出生时，检查眼睑色素情况，确定是否是嵌合体。,使用同工酶分析,首先分析动物特定的同工酶谱系，然后选择具有不同图谱的两种或多种动物作为供体动物提供胚胎。如果获得的动物是嵌合体，那么同工酶谱中应显现与供体动物相对应的特定谱带，不同品种动物的同工酶均有表现。,现在比较常用的是磷酸葡萄糖异构酶（GPI）分析，其原理是果糖6磷酸在GPI作用下，产生葡萄糖6磷酸，在6磷酸葡萄糖脱氢酶和NADP作用下，使G6P成为6磷酸葡萄糖酸盐，NADP还原为NADPH。经GPI染液染色，可显示出同工酶谱带。分析时，从嵌合动物中取不同组织器官，匀浆后制成电泳样本，在醋酸纤维素板上点样，电泳、染色处理。与标准的同工酶谱对照，鉴定是否是嵌合体。,胚胎嵌合的意义胚胎嵌合技术可以作为研究分析哺乳动物发生机制的重要手段，例如研究卵裂球分化潜力，研究性分化机制与性比，研究X染色体失活及其作用和研究胚胎细胞基因表达的机制；也可以对生理功能分析的应用，例如对免疫功能、遗传病的研究分析；还可以培育杂种个体，甚至是种间杂种；可以通过制作各种组合的嵌合体，培育新的毛皮动物；利用种间移植，分析胎儿和母体的相互关系。,三、胚胎分割,、胚胎分割的原理根据卵裂球具有发育成为一个个体的全能性的特点，人们就考虑用这种实验技术，生产同卵双胎或多胎，以加速优良种群的繁殖。胚胎的分割在不同时期有不同的分离培养方法，如卵裂球分离培养法、致密化前各期胚胎分割法