分子生物学第六章：DNA损伤与修复

.,1,第六章DNA损伤与修复DNAdamageandrepair,汤立军中南大学生物科学与技术学院分子生物学研究中心,.,2,哺乳动物细胞DNA损伤的发生频率,.,3,.,4,.,5,复制错误碱基脱落或部分脱落活性氧族,紫外线电离辐射,烷化剂碱基类似物修饰剂,DNA,第一节DNA损伤的原因及后果,.,6,一、DNA分子的自发性损伤(一)DNA复制产生误差大肠杆菌中DNA复制为例：碱基配对的错误率为10-110-2复制后经校正系统校正，错配率为10-9左右,.,7,（二）DNA的自发性化学变化1.碱基的异构互变DNA分子中的4种碱基各自的异构体间都可以自发地相互变化(例如酮式-烯醇式或氨基-亚氨基之间的结构互变)，使配对碱基间的氢键改变。,.,8,碱基的互变异构效应,碱基T和G能够以酮式或烯醇式两种互变异构的状态出现碱基C和A能够以氨基式或亚氨基式两种互变状态出现一般生理条件下，碱基互变平衡反应倾向于酮式或氨基式，故AT和CG碱基配对,.,9,互变异构效应引起不正常的碱基配对,碱基T以稀有的烯醇式形式，新合成链中T对应的不再是A，而是G,碱基C以稀有的亚氨基形式出现，在DNA复制到达这一位置的瞬间，则它对应的不是G，而是A,.,10,2.碱基的脱氨基作用碱基的环外氨基有时会自发脱落，从而胞嘧啶(C)变成尿嘧啶(U)，腺嘌呤(A)变成次黄嘌呤(H)、鸟嘌呤（G）变成黄嘌呤(X)等。复制时U与A配对、H和X都与C配对就会导致子代DNA序列的错误变化。,.,11,3脱嘌呤与脱嘧啶,即碱基脱落，是指从DNA上丢失了嘌呤或嘧啶，形成无碱基位点，称为AP部位（apurine,apyrimidinesite,AP）。,.,12,复制时可以插入任何核苷酸。脱落碱基后的脱氧核糖3端的磷酸二酯键易被水解，造成DNA链断裂。在哺乳动物细胞基因组中，每天每个细胞因N-糖苷键自发水解约丢失10000个嘌呤碱基和200个嘧啶碱基。,.,13,细胞在正常生理活动中产生的活性氧会造成DNA损伤，产生胸腺嘧啶乙二醇、羟甲基尿嘧啶等碱基修饰物，还可引起DNA单链断裂等损伤。每个哺乳类细胞每天DNA单链断裂发生的频率约为五万次。,4碱基修饰与链断裂,.,14,5.环出效应,.,15,二、物理因素引起的DNA损伤,(一)紫外线照射引起的DNA损伤当DNA受到最易被其吸收波长(260nm)的紫外线照射时，同一条DNA链上相邻的嘧啶以共价键连成二聚体，相邻的两个T、或两个C、或C与T间都可以环丁基环(cyclobutanering)连成二聚体，其中最容易形成的是T-T二聚体。二聚体导致复制不能进行。,.,16,.,17,.,18,皮肤因受紫外线照射而形成二聚体的频率可达每小时5104细胞，紫外线不能穿透皮肤，因此损伤只局限在皮肤中。此外，紫外线照射还能引起DNA链断裂等损伤。,.,19,电离辐射损伤DNA有直接和间接的效应，直接效应是DNA直接吸收射线能量而遭损伤；间接效应是指DNA周围其他分子(主要是水分子)吸收射线能量而产生具有很高反应活性的自由基，进而损伤DNA。,(二)电离辐射引起的DNA损伤,.,20,电离辐射引起DNA损伤的机理,.,21,电离辐射引起DNA损伤的机制,自由基损害,损伤DNA修复系统,MCI假说(mobilechargeinteraction)直接与DNA分子链发生作用，作用的靶点是DNA分子中移动的电子。,.,22,电离辐射引起DNA损伤的类型,产生OH自由基，导致碱基变化,脱氧核糖分解,DNA链断裂,交联包括DNA链交联和DNA-蛋白质交联,.,23,电离辐射导致DNA链的断裂,单链断裂：双链断裂：,.,24,三、化学因素引起的DNA损伤,(一)烷化剂对DNA的损伤烷化剂是一类亲电子的化合物，很容易与生物大分子的亲核位点起反应，使DNA发生各种类型的损伤。1碱基烷基化烷化剂很容易将烷基加到DNA链中嘌呤或嘧啶的N或O上,烷基化的嘌呤碱基配对会发生变化。,.,25,鸟嘌呤,胞嘧啶,O6-乙基鸟嘌呤,胸腺嘧啶,.,26,(一)烷化剂对DNA的损伤2.碱基脱落烷化鸟嘌呤的糖苷键不稳定，容易脱落形成DNA上的无碱基位点，复制时可以插入任何核苷酸，造成序列的改变。,.,27,(一)烷化剂对DNA的损伤3断链DNA链的磷酸二酯键上的氧也容易被烷基化，结果形成不稳定的磷酸三酯键，易在糖与磷酸间发生水解，使DNA链断裂。,.,28,(一)烷化剂对DNA的损伤,4.交联烷化剂有两类，一类是单功能基烷化剂，如甲基甲烷碘酸，只能使一个位点烷基化；另一类是双功能基烷化剂，如化学武器氮芥、硫芥等，一些抗癌药物如环磷酰胺、苯丁酸氮芥、丝裂霉素等，某些致癌物如二乙基亚硝胺等均属此类，其两个功能基可同时使两个位点烷基化。,.,29,(二)碱基类似物、修饰剂对DNA的损伤,人工合成的碱基类似物如5-溴尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、2-氨基腺嘌呤等，其结构与正常碱基相似，进入细胞能替代正常碱基掺入到DNA链中而干扰DNA复制。,例如5-溴尿嘧啶的结构与胸腺嘧啶十分相近。,.,30,5-BrdU（5-BrdU-A；5-BrdU-G）酮式烯醇式,碱基类似物、修饰剂对DNA的改变,亚硝酸盐能使C脱氨基变成U（CU）,羟胺能使T脱甲基变成C（TC）,黄曲霉素B（攻击碱基）,.,31,DNA损伤类型,碱基脱落碱基修饰丧失某些功能;改变基因型(genotype)而不改变表现型(phenotype);发生有利于物种生存的结果,使生物进化。,.,36,第二节DNA修复,DNA的修复主要类型:,错配修复直接修复切除修复重组修复跨损伤修复(SOS修复),.,37,一、错配修复,在DNA复制过程中,DNA聚合酶能够利用其3一5外切核酸酶活性去除错配核苷酸，但是这种校正作用并不十分可靠,某些错配核苷酸可能逃避检测,出现于新合成的DNA链中。错配修复系统能够发现和修复这些错配核苷酸。,.,38,1.E.coli错配修复机制,DNA腺嘌呤甲基化酶(m6A甲基化酶),解旋酶Helicase、SSB、外切核酸酶(、X和RecJ)、DNApolymerase、连接酶,MCE(mismatchcorrectenzyme),mutL激活内切核酸酶mutH,mutS扫描新生链中错配碱基,mutH识别非甲基化DNA链;酶切含错配碱基的DNA区段,错配修复系统组成（Mismatchrepairsystem）,.,39,错配修复,.,40,错配修复,(大肠杆菌),Mis-pairedbases,.,41,错配修复(大肠杆菌),.,42,2.真核细胞错配修复机制,.,43,.,44,.,45,错配修复(人),.,46,二、直接修复,1.DNA断裂口直接修复在DNA5-P端和3-OH端未受损伤的情况下，连接酶能够直接修复DNA的断裂口。,.,47,2.光复合酶直接修复二聚体,.,48,3.直接修复烷基化碱基,O6-甲基鸟嘌呤甲基转移酶。甲基从DNA转移至烷基转移酶上,已经甲基化的酶不能再转变为非甲基化酶,因此,此种修复又称为该酶的自杀性修复。,.,49,DNA链上嘌呤的脱落造成无嘌呤位点，能被DNA嘌呤插入酶(insertase)识别结合，并在K存在下催化游离的嘌呤碱基或脱氧核苷与DNA无嘌呤部位形成糖苷键。且催化插入的碱基有高度专一性、与另一条链上的碱基严格配对，使DNA完全恢复。,4直接插入嘌呤,.,50,三、碱基切除修复（BaseExcisionRepair，BER）,指切除和替换由内源性化学物作用产生的DNA碱基损伤,是切除修复的一种。受损碱基移除是由多个酶来完成的。主要针对DNA单链断裂和小的碱基改变及氧化性损伤。,.,51,.,52,.,53,碱基切除修复（人）,.,54,四、核苷酸切除修复（nucleotideexcisionrepair）,体内识别DNA损伤最多的修复通路。,不识别任何特殊的碱基损失，而是识别双螺旋形状的改变；修复时切除含有损伤碱基的那一段DNA。,.,55,.,56,.,57,核苷酸切除修复(大肠杆菌),UvrA:识别损伤部位UvrB:解旋双链,紫外线诱导uvrA、uvrB、uvrC和uvrD四种基因表达,.,58,UvrC:5末端内切,UvrB:3末端内切,.,59,UvrD:解旋酶,.,60,.,61,核苷酸切除修复(基因组修复人),.,62,核苷酸切除修复(转录偶联修复-人类),.,63,GGR和TCR的共同修复通路,.,64,.,65,五、重组修复,大肠杆菌重组修复,.,66,五、重组修复,根据DNA末端连接需要的同源性分为:同源重组：需要多种蛋白参与,在减数分裂、细胞有丝分裂后期S/G2期起主要作用。非同源末端连接：DNA分子之间不需要广泛的同源性，主要是在免疫球蛋白重组时对DNA双链进行连接，在细胞有丝分裂G1/G0期起主要作用。,.,67,同源重组修复DNA双链断裂（人）,.,68,非同源末端连接修复DSB,.,69,六、SOS修复,正在复制的DNA聚合酶可能遇到尚未修复的DNA损伤，例如胸腺嘧啶二聚体或无嘌呤位点，复制体必须设法跨越损伤进行复制，或者被迫暂停复制。即使细胞不能修复这些损伤，自动防故障系统能够使复制体绕过损伤部位，这一机制就是跨损伤DNA合成。SOS修复存在于大肠杆菌，不存在于人类。,.,70,.,71,.,72,RecA-P的三种功能,当DNA正常复制时,（无复制受阻，无DNA损伤，无TTdimer）,RecA-p不表现proteinase活性,.,73,.,74,当DNA复制受阻/DNAdamaged,细胞内原少量表达的RecA-p,与S.S.DNA结合,激活RecA-p的proteinase活性,LexA-p降解