动物分子克隆载体

第 七 节动物分子克隆载体,一. 构建动物克隆载体的病毒种类和特征病毒类型 例子 病毒大小(nm) 基因组结构 基因组大小(kb)细小病毒 野生型 H-1,RV,MVM 20 ss-DNA 1.8-2.7 缺陷型 AAV 乳多空病毒 乳实瘤 兔,人(BPV) 30-50 环状ds-DNA 4.5-7.5 多型瘤 小鼠肿瘤 空泡 SV40，BKV腺病毒 人(AD) 80-90 ds-DNA 30-40 疱疹病毒 HSV,EBV 100-150 ds-DNA 80-140痘病毒 300200100 ds-DNA 240-300逆病毒 MLV,MSV 100-120 ss-RNA 8.5,二. 病毒型载体 1. 特点 1)可在动物细胞中形成病毒颗粒（形态构成组分来自天然病毒或原病毒细胞） 2)DNA转移效率高，但必须与天然(辅助)病毒共感染动物细胞 3) 大多数被感染动物细胞将是致死的，但有少数病毒（如逆病毒）载体可稳定整合到染色体DNA中。4) 插入病毒载体的外源基因只能在动物细胞中作瞬时表达 2. 载体种类 根据构建载体的病毒基因大小可分为两类：,1）复制型：由小分子病毒DNA 构建而成，具复制起点，其克隆位点可在病毒DNA之内，亦可在病毒DNA之外，这类载体有的容量十分有限（如SV40），有的则很大（如HSV），其容量大小主要取决于病毒外壳蛋白的包装能力。 2）非复制型：这类载体是在细菌克隆载体中插入一段病毒DNA（不含复制起点）。当外源DNA插入该载体后，与相应的天然病毒一起感染动物细胞，外源DNA可借助两病毒DNA同源部分的重组插入天然病毒。这类载体特别适合于那些较大的病毒DNA分子。 实例：痘病毒长180kb,编码150多种多肽，整个生存阶段均在细胞质内，它能合成DNA复制、转录和转录后修饰的各种酶类，由此病毒构建的非复制型载体就是在细菌载体中插入一段痘病毒DNA.,三. 质粒型载体 1. 特点：不能形成病毒颗粒，以高拷贝质粒形式存在于动物细胞内，不导致动物细胞死亡。 2. 组成：pMB1和病毒复制起点（如SV40，BPV，EBV等），适合于细菌和动物细胞的选择标记基因。 3.实例 1)SV40质粒载体 SV40具如下物理图谱，5243bp, 为两种抗原（T-和t-抗原）和三种病毒衣壳蛋白编码。其中T-抗原参与SV40的有效感染，并能特异地结合在病毒DNA复制起点上，这种结合对DNA复制是必须的。因复制起点与该基因的启动子顺序相近，故它本身的表达也受到T-抗原的控制。 当含SV40复制起点的质粒型载体或重组DNA分子转入COS细胞后(含有SV40的T-抗原)可大量复制, 其拷贝数可达20-40万。,SV40质粒载体,2)BPV-1质粒载体 BPV-1中69T是转化动物细胞所必需的, 约占该病毒DNA总长的69%, 单向转录。由69T和E.coli质粒载体构成穿梭质粒载体。,BPV质粒载体,三. 整合型载体 这类载体可借助同源重组作用使外源基因插入染色体或病毒基因组中。 1. 逆病毒克隆载体 1) 逆病毒用于载体的优点: i. 基因组小, 易于操作 ii.高滴度, 易于导入细胞 iii.准确整合入受体细胞染色体中, 外源基因可稳定表达，具有强转录增强子, 可在多种细胞中高效表达外源基因,2) 逆病毒载体的用途 i.基因治疗 ii.在胚胎组织中研究特定基因的发育功能 iii.可用作家系标记 iv.导入生殖细胞或胚胎干细胞, 产生转基因动物 v.用作插入突变剂 vi.用于逆病毒分子生物学研究 3) 逆病毒的生活史和基因组结构 生活史: 病毒粒子感染 反转录为线状ds-DNA 整合到染色体中转录为2个mRNA分子 翻译成病毒蛋白 包装成病毒粒子 释放到细胞外,结构: i.长末端重复(long terminal repeat, LTR) ii.正链和反链引物序列PB(-), PB(+) iii.包装序列(gag基因编码区5-端420 bp序列) iv.反式作用基因: gag核心蛋白; pol反转录酶/整合酶; env-外壳糖蛋白 v.RNA剪接供体和受体序列SD, SA 4) 逆病毒的宿主范围 i. 种特异性-窄谱(ecotrophic): 如M-MLV仅限于鼠细胞；广谱(amphotropic): 如MLV在鸟和哺乳动物细胞, 用M-MLV所构建的载体也可具广谱性, 只要用广谱逆病毒的外壳蛋白包装即可 ii.组织特异性-成纤维细胞, 淋巴细胞, 上皮细胞 iii.免疫性,5) 逆病毒克隆载体 i.单基因载体 仅保留逆病毒的LTR序列, 无标记基因 ii.双基因载体: 剪接载体; 内启动子载体; 双顺反子载体。 在剪接载体中, 逆病毒的LTR序列和剪接位点保留, 两基因共用一个启动子和翻译起始区; 在双顺反子载体中, 两基因共用一个基因启动子, 但有各自的翻译起始区; 在内启动子载体中, 两基因各有自己的启动子 iii.自失活载体(self-inactivation vector) iv.自主复制载体(replication-competent vector) 2. 痘病毒克隆载体 将痘病毒的部分DNA插入细菌载体中, 借助同源序列的重组作用整合到病毒基因组中,逆病毒的结构和载体结构,3. 昆虫核型多角体病毒载体 该类病毒载体是病毒整合型表达载体，具有以下优点： 1）外源基因可获得高表达：1-500mg/L 培养物 2）表达产物仍具有生物学活性 3）重组效率高,昆虫杆状病毒表达系统,昆虫杆状病毒的转移载体和表达载体,三. 标记基因 1.tk基因和dhfr基因(胸苷激酶和二氢叶酸还原酶基因) 需相应的突变体 2.gpt基因（来自E.coli） 非转化细胞可生长在加有氨基喋呤和霉酚酸，腺嘌呤的培养