第十七章分子标记PPT课件

.,1,第十八章分子标记辅助选择育种,.,2,作物育种对农业的贡献,农作物优良新品种的推广应用在提高产量方面的贡献率约占40%。建国以来，已先后培育出40多种农作物的5000多个新品种和组合，使我国农作物品种平均更新了34代，每更新一次，农作物增产约10%-30%。水稻从单季稻改为双季稻、高杆改为矮杆、常规稻改为杂交稻、常规杂交稻改为超级杂交稻等几次重大的变革均离不开品种改良。,.,3,传统育种手段的不足,传统育种一般是首先通过各种途径创造遗传变异，然后从分离群体的后代中进行优化选择和评价，而这种选择是建立在植株的表现型基础之上的，这就要求育种家必须具有丰富的实践经验，而且费时、费力。作物的许多重要农艺性状为数量性状，如产量等；或为多基因控制的质量性状，如抗性等；或为表型难以准确鉴定的性状，如根系活力等。此时根据表现型来对性状遗传力进行评价是不确切的，因而选择是低效的。,.,4,第一节.遗传标记,遗传标记（geneticmarker）:指可追踪染色体、染色体某一节段、某个基因座在家系中传递的任何一种遗传特性。它具有两个基本特征，即可遗传性和可识别性；因此生物的任何有差异表型的基因突变型均可作为遗传标记。,.,5,遗传标记的类型,形态学标记（morphologicalmarker）细胞学标记(cytologicalmarker)生化标记(biochemicalmarker)分子标记(molecularmarker)：DNA分子遗传标记，或DNA标记。,.,6,1.形态标记(morphologicalmarkers)：是指植物的外部形态特征，如矮秆、白化、黄化、变态叶、雄性不育等。广义上还包括色素、生理特征、生殖特性、抗虫抗病性等。形态标记的获得一般通过自然突变或物化诱变来获得具有特定形态特征的遗传标记材料，然后通过两点或三点连锁测定法确定标记基因与目标性状之间的关系。通过不同标记基因材料之间的相互杂交，可以选择出具有多个标记基因的材料。,.,7,棉花多标记基因材料,.,8,普通玉米与高直链淀粉玉米籽粒形态,ae基因具有无光泽胚乳的表现型在很多遗传背景中很容易鉴别。,高直链淀粉玉米,普通玉米,.,9,形态标记的不足之处（1）数量有限，而人工培育形态标记材料的周期长；（2）一些形态标记的多态性差，易受环境因素的影响；（3）一些形态标记对植株的表型影响太大，与不良性状连锁。,.,10,2.细胞学标记(cytologicalmarkers)：是指细胞内染色体的变化，包括染色体数目的变化(如单体、缺体、三体、四体)或染色体结构的变异(如缺失、易位、倒位、重等)。可通过染色体核型（染色体数目、大小、随体有无、着丝粒位置等）和带型（C、N、G等）分析来测定基因所在的染色体及相对位置，或通过染色体置换等进行基因的定位。,.,11,细胞学标记的不足之处：（1）细胞学标记材料的选育需要花费大量的人力和较长的时间；（2）某些物种对染色体数目和结构变异反应敏感，有些则适应变异的能力差；（3）一些不涉及染色体数目、结构变异或带型变异的性状则难以用细胞学方法检测；（4）难以开展基因的精细定位。,.,12,3.生化标记(biochemicalmarkers)主要包括贮藏蛋白、同工酶和等位酶等。种子中的贮藏蛋白主要包括白蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白四种。不同植物种子中的贮藏蛋白含量不同。生化标记的使用首次突破了把整株样品作为研究材料进行分析的方式，并可以直接反映基因产物的差异，受环境的影响较小。但标记数量远远不能满足实际的需要。,.,13,同工酶(isozyme)：电泳所可区分的同一种酶（系统）的不同变化。等位酶(allozyme)：由一个位点的不同等位基因编码的同种酶的不同类型，其功能相同但氨基酸序列不同。,.,14,4.分子标记(molecularmarkers)是指基因组DNA分子水平之间的差异。优越性：（1）直接以DNA的形式表现；（2）数量多，遍及整个基因组，检测位点近乎无限；（3）多态性高，不需要专门创造特殊的遗传材料；（4）不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁；（5）有许多分子标记表现为共显性。,.,15,第二节分子标记的主要类型及基本原理,.,16,(一)DNA的半保留复制机制,.,17,(二)PCR的基本原理,PCR是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法。DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。,.,18,.,19,PCR反应的基本过程,PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成变性：模板DNA经加热至94左右，使模板DNA双链解开成为单链，以便它与引物结合；退火：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合成局部双链；延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的催化作用下，以dNTP为反应原料，按碱基配对与半保留复制原理，引物沿53方向延伸，最终合成一条新的与模板DNA链互补的DNA链。,.,20,.,21,(三)PCR反应体系的基本成分：,10PCRBufferMgCl2或MgSO4dNTPMixture(dATP,dTTP,dCTP,dGTP)引物(随机引物或特异引物)模板DNATaqDNApolymerasedsH2O,.,22,(四)PCR扩增产物的分析,琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳,.,23,琼脂糖凝胶电泳,PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，EB染色后，在紫外透射仪下观察，初步判断产物的特异性。PCR产物片段的大小应与预计的一致，特别是多重PCR，应用多对引物，其产物片断都应符合预计的大小。一般用于较大片段的分离。,.,24,琼脂糖凝胶电泳,.,25,聚丙烯酰胺凝胶电泳,PCR产物经聚丙烯酰胺凝胶垂直板高压电泳后，多采用AgNO3染色，在白色光源下观察，初步判断产物的特异性。一般用于条带复杂且片段小(800bp)的PCR产物的分离。,.,26,聚丙烯酰胺凝胶电泳,.,27,一、以分子杂交为基础的DNA标记技术,限制性片段长度多态性（Restrictionfragmentlengthpolymorphisms，RFLP）可变数目串联重复序序列（Variablenumberoftandemrepeats，VNTR）染色体原位杂交（InSituHybridization）,.,28,二、以PCR为基础的DNA标记技术,随机扩增多态性DNA（RandomamplificationpolymorphismDNA，RAPD）简单重复序列间区DNA（Inter-simplesequencerepeatspolymorphisms，ISSR）简单重复序列DNA（Simplesequencerepeats，SSR）扩增片段长度多态性（Amplifiedfragmentlengthpolymorphisms，AFLP）序列标签座位（Sequence-taggedsites，STS）序列特征化扩增区域（Sequencecharacteredamplifiedregion，SCAR）,.,29,三、其它类型的分子标记,单核苷酸多态性（Singlenucleotidepolymorphism，SNP）表达序列标签（Expressedsequencestags，EST）反转录转座子（Retro-transposon）,.,30,四、显性标记和共显性标记,显性标记(dominantmarkers)：是指F1的多态性片段与其亲本之一完全相同。如RAPD、AFLP、ISSR等。共显性标记(co-dominantmarkers)：是指双亲的两个以上分子量不同的多态性片段均在F1中表现。如RFLP、SSR、SCAR等。,.,31,F1P1P2,显性标记,.,32,.,33,五、几种主要的分子标记,.,34,(二)RAPD标记,对于特定的遗传材料，如果基因组在特定引物结合区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变，就可能导致特定引物结合位点分布发生相应变化，导致PCR产物增加、缺少或发生分子量变化,通过电泳分析即可检测出基因组DNA在这些区域的多态性。,.,35,.,36,五、分子标记的原理和遗传特性,(二)RFLP标记1.RFLP标记的原理植物基因组DNA上的碱基替换、插入、缺失或重复等，造成某种限制性内切酶酶切位点的增加或丧失，从而产生限制性片断长度多态性。,.,37,(三)、SSR标记,SSR即简单重复序列，又称微卫星DNA，它是一类由1-6个碱基组成的基序串联重复而成的DNA序列，其长度一般较短，它们广泛分布于基因组的不同位置。如（CA）n、(AT)n、(GGC)n、(GATA)n等重复.根据微卫星DNA两端的单拷贝序列设计一对特异引物，利用PCR技术，扩增每个位点的微卫星DNA序列，通过电泳分析核心序列的长度多态性。一般地，同一类微卫星DNA可分布于整个基因组的不同位置上，而通过其重复的次数不同以及重叠程度的不完全而造成每个座位的多态性。,.,38,(四)AFLP标记,AFLP即扩增片段长度多态性，是1993年由Zabeaumarc和Vospieter发明创造的一种DNA分子标记。该技术是对限制性酶切片段的选择性扩增，又称基于PCR的RFLP。鉴于AFLP标记的多态性强，一次可检测到100-150个扩增产物，因而非常适合绘制品种指纹图谱及进行分类研究。,.,39,对基因组DNA进行双酶切，在使用的两种限制性酶中，进一步将酶切片段和含有与其粘性末端相同的人工接头连接，连接后的接头序列及临近内切酶识别位点就作为以后PCR反应的引物结合位点，通过选择在末端上分别添加1-3个选择性碱基的不同引物，选择性地识别具有特异配对顺序的酶切片段与之结合，从而实现特异性扩增,.,40,.,41,.,42,五、SNP标记,SNP即单核苷酸多态性标记，主要是指由基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性，包括单碱基的转换、颠换以及单碱基的插入/缺失等。SNP位点的丰富性。SNP几乎遍及整个基因组。据估计，基因组中大约平均每1000bp就会出现1个SNP。SNP标记的遗传稳定性要比SSR等标记高得多，且在群体中也是按孟德尔规律遗传。用于遗传分析或基因诊断中，其重现性和准确性大大提高。,.,43,SNP=SingleNucleotidePolymorphism,.,44,第三节.分子标记辅助选择(MAS),标记辅助选择的主要方面是对目标基因的选择，有人称之为前景选择（foregroundselection）。前景选择的可靠性主要取决于标记与目标基因间连锁的紧密程度。若只用一个标记对目标基因进行选择，则标记与目标基因间的连锁必须非常紧密，才能够达到较高的正确率。,一、遗传基础,.,45,分子标记辅助选择(MAS)的遗传基础,若重组率为p，则F2的MM群体中，RR的概率为（1-p）2，Rr的概率为2p（1-p），错选株ss的频率仅为p2。即重组值越小，其错选率越低。,.,46,对基因组中其他部分（即遗传背景）选择，称为背景选择（backgroundselections）。背景选择的对象几乎包括了整个基因组，因此，这里牵涉到一个全基因组选择的问题，在分离群体中，由于在上一代形成配子时同源染色体之间会发生交换，因此每条染色体都可能是由双亲染色体重新组装的杂合体。,.,47,.,48,二.分子标记的优越性,1.克服性状表现型鉴定的困难.2.允许早期选择.3.控制单一性状的多个（等位）基因的利用.4.允许同时选择多个性状.5.可进行性状非破坏性评价和选择.6.从育种进程考虑，可加快育种进程，提高育种效率.,.,49,目标基因的标记筛选（genetagging）是进行分子标记辅助选择（MAS）育种的基础。用于MAS育种的分子标记须具备以下条件：,分子标记与目标基因紧密连锁。标记实用性强，重复性好，而且能够经济简便地检测大量个体。不同遗传背景选择有效。如果不与目标基因紧密连锁，可利用其它探针保证目标基因两侧都有标记（15cM）,三.分子标记辅助选择应具备的主要条件,.,50,第三节分子标记辅助选择(MAS)在作物遗传育种中的应用,遗传图谱的构建与重要农艺性状基因的标记近等基因系的培育(NIL)与重要农艺性状基因的标记群体分离分析法(BSA)与重要农艺性状基因的标记,.,51,(一)遗传图谱的构建与重要农艺性状基因的标记,1遗传作图的原理其原理是基于染色体的交换与重组。在细胞减数分裂时，非同源染色体上的基因相互独立，自由组合，而位于同源染色体上的连锁基因在减数分裂前期I非姊妹染色单体间的交换而发生基因重组，用重组率来表示基因间的遗传距离。遗传图谱只显示基因间在染色体上的位置，并不反映DNA的实际长度。,.,52,ae基因两侧SSR标记遗传连锁图谱,.,53,2构建遗传图谱的主要环节,.,54,构建遗传图谱，首先要选择合适的亲本及分离群体，而且亲本之间的差异不宜过大，否则会降低所建图谱的准确度和适用性。,.,55,用于分子标记的遗传作图可分为两类：,暂时性分离群体：包括F2、F3、F4、BC、三交群体等，这类群体中分离单位是个体，一经自交或近交其遗传组成就会发生变化，无法永久使用，由于每个单株所提供的DNA有限，且只能使用一代，限制了该群体的作图能力；永久性分离群体：包括RIL、DH等，这类群体中分离单位为株系，不同株系之间存在基因型的差异，而株系内个体之间的基因型是相同且纯合的，自交后不会发生分离，因此可通过自交或近交繁殖后代，而不会改变群体的遗传组成，可以永久使用。,.,56,F2群体,.,57,F2群体的特点,F2群体构建比较省时，不需很长时间便可得到一个较大的群体，这是使用F2群体进行遗传作图的最大优点。F2群体中存在杂合基因型，对于显性标记将无法识别显性纯合基因型和杂合基因型，由于这种基因型信息简并现象的存在，会降低作图的精度。通过远缘杂交而来的F2分离群体，则远缘杂交亲本后代向两极疯狂分离，标记比例易偏离3：1。,.,58,延长F2使用时间的措施,采用无性繁殖，如进行组织培养扩繁、留蔸再生等。使用F2单株的衍生系（F3株系或F4家系），将衍生系内多个单株混合提取DNA，则能代表原F2单株的DNA组成。从衍生系中选取单株必须是随机的，且株数要足够多。,.,59,BC1群体,.,60,BC1群体的特点,BC1群体中每一分离的基因座只有两种基因型，它直接反映了F1代配子的分离比例，因而BC1群体的作图效率是最高的。由于该群体的配子类型较少，统计及作图分析较为简单，但提供的信息量少于F2群体，且可供作图的材料有限，不能多代使用。对于一些人工杂交比较困难的植物，BC1群体不太适合用来作图，一是难以建立较大的BC1群体，二是容易出现假杂种，造成作图的误差。,.,61,RIL群体,.,62,RIL的特点,RIL群体一旦建立，就可以代代繁衍保存，有利于不同实验室的协同研究，而且作图的准确度更高。异花授粉植物由于存在自交衰退和不结实现象，构建RIL群体比较困难。建立RIL群体相当费时。,.,63,DH群体,.,64,DH群体的特点,DH植株是纯合的，自交后即产生纯系，因此DH群体能够稳定繁殖，长期使用。DH群体的遗传结构直接反映了F1配子中基因的分离和重组，因此DH群体与BC1群体一样其作图效率是最高的。构建DH群体需精湛的花培技术和染色体加倍技术，同时所提供的信息量也明显低于F2群体。植物的花培能力跟基因型关系较大，因而花培过程会对不同基因型的花粉产生选择效应，从而破坏DH群体的遗传结构，造成严重的偏分离现象，影响到遗传作图的准确性。,.,65,不同作图群体的特点,.,66,(二)、近等基因系的培育与重要农艺性状基因的标记,不利性状基因,.,67,.,68,(三)、群体分离分析法(BSA)与重要农艺性状基因的标记,.,69,(三)、群体分离分析法与重要农艺性状基因的标记,BSA法是从近等基因系分析法演化而来的，它克服了许多作物没有或难以创建相应的NIL的限制，在自交和异交物种中均有广泛的应用前景。对于尚无连锁图或连锁图饱和程度较底的植物，利用BSA法也是快速获得与目标基因连锁的分子标记的有效方法。,.,70,1、BSA分析法的原理,在作图群体中，依据目标性状表型的相对差异（如抗病与感病、可育与不育等），将个体或株系分成两组，分别将两组中的个体或株系的DNA等量混合，形成相对的DNA池（DNApool）。这两个DNA池之间除了在目标基因座所在染色体区域的DNA组成上存在差异外，来自基因组其它部分的DNA组成应该是完全相同或基本相同的，即两DNA池间差异相当于两近等基因系基因组之间的差异，或者说构成了一对近等基因DNA池。因此在这两个DNA池之间表现出多态性的DNA标记，就有可能与目标基因连锁。,.,71,2、基本步骤,遗传分析阐明性状是否受一对或少数几对基因控制，以及基因的分离是否符合孟德尔规律。根据目标性状表型或基因型的相对差异构建两个近等DNA池或代表群，寻找在两者之间表现多态性的标记。利用分离群体验证候选标记是否与目标基因紧密连锁。根据标记基因型的分离比例和单株目标性状分离比例进行遗传作图。,.,72,R/R,r/r,R,r,P:,F2:,F1:,.,73,.,74,第四节.进行MAS选择的限制因素,作物基因作图速度还相当缓慢，一些重要性状的分子标记与目标性状见的遗传距离仍较大，不符合MAS的要求。已筛选出的分子标记在不同遗传背景中表现不稳定，甚至同样的目标基因同样的标记在不同群体中其重组率会有差异。特别是呈数量性状遗传的性状的分子标记更易受遗传背景影响。,.,75,基于PCR技术的标记数量有限。特别是已筛选到一些与重要农艺性状基因的分子标记大都不是PCR标记，因此不易应用于MAS中。利用分子标记技术进行MAS的成本较高，不能满足大规模育种选择的需要。生物技术手段与常规育种严重脱节。作物育种学家与分子遗传学家之间的有机结合、沟通不够。,.,76,第二节分子标记辅助选择的策略,.,77,一、作物MAS育种须具备的条件分子标记与目标基因共分离或紧密连锁，一般要求两者间的遗传距离小于5cM,最好1cM或更小。主要是应用PCR技术。筛选技术在不同实验室间重复性好，且具有经济、易操作的特点。具有实用化程度高并能协助育种家作出抉择的计算机数据处理软件。,.,78,二、MAS育种方法（一）回交育种（二）SLS-MAS（三）MAS聚合育种,.,79,回交育种,.,80,受体亲本供体亲本A(无优质基因)(含优质基因A),受体亲本供体亲本B(无优质基因)(含优质基因B),F1(含优质基因A)F1(含优质基因B),复杂杂种(分离群体),受体亲本供体亲本C(无优质基因)(含优质基因C),中选杂种个体F1(含优质基因A和B)(含优质基因C),复杂杂种(分离群体),中选杂种个体受体亲本(含优质基因A、B和C),新育成的优质品种(受体亲本遗传背景+优质基因A、B和C),回交12代，标记辅助选择,自交,标记辅助选择,标记辅助选择,标记辅助基因聚合,与品质改良相结合程序图,.,81,大范围群体内的单目标基因MAS（SLS-MAS）分析方法,基本原理是在一个随机杂交的混合群体中，首先在一个很大群体中利用分子标记辅助选择目标性状，尽可能使选择群体足够大，使中选的植株就目标位点纯合，而在目标位点以外的其它基因位点上保持有大的遗传多样性，最好仍呈孟德尔分离，这样，分子标记筛选后，仍有很大遗传多样性供育种家通过传统育种方法选择，产生新的品种和杂交种。这种方法对于分子标记辅助选择质量性状或数量性状均适用。,.,82,利用传统育种方法结合DNA指纹图谱选择用于MAS的优异亲本，特别对于数量性状而言，不同亲本针对同一目标性状要具有不同的重要的QTL。即具有更多的等位多样性。确定某重要农艺性状QTL标记。利用中选亲本与测验系杂交，将F1自交产生分离群体，一般200-300株，结合F2-3株行田间调查结果，以确定主要QTL的分子标记。结合筛选的QTL标记，对上述分离群体中单株进行SLS-MAS。根据标记有无选择目标材料。由于连锁累赘，除中选QTL标记外，使其附近其它位点保持最大的遗传多样性。进一步通过中选单株自交，根据本地生态需要进行系统选择，育成新的优异品系。或将中选单株与测验系杂交产生新杂种。,.,83,三、提高分子标记的筛选效率,（一）多重PCR方法（二）用相斥相分子标记进行育种选择（三）克服连锁累赘（四）降低MAS育种的成本,.,84,多重PCR方法为了增加标记的筛选效率，当同时筛选到与2个或2个以上目标性状连锁的几个不同的分子标记时，如果这几个分子标记的扩增产物具有不同长度，则一对以上的引物可在同一PCR条件下同时反应。采用多重PCR，要注意在设计或选择引物时，必须考虑各引物复性温度是否相匹配，且在扩增产物的大小上无重叠。研究表明，多重扩增使用Taq酶量与一个引物扩增用量相同，这显著地降低了筛选成本和筛选时间。,.,85,用相斥相分子标记进行育种选择所谓相斥相分子标记指与目标性状相斥连锁的分子标记，即有分子标记，植株不表现目标性状；无分子标记，植株表现目标性状。通过相斥标