多克隆抗体制备ppt课件

.,多克隆抗体制备,.,多克隆抗体的制备方法,.,动物选择,一、选择制备多克隆抗体(抗血清)的动物种类应考虑的要点:需要制备的抗血清的质量;供给蛋白质抗原的动物与免疫动物之间的种系关系;免疫动物产生的抗体特性（针对不同性质的免疫原选用相应的动物）。二、动物的年龄、性别和数量对抗体制备的影响优先选取青壮年动物；雌性动物的免疫应答状况,无论是细胞性还是体液性免疫都比雄性个体强烈。,.,家兔,家兔是最适合制备抗体的动物。其体型适中,成年体重为26kg,一次采血量可达2550ml,全放血量则达100180ml;性格驯顺,易于操作和采血;寿命相对较长,为58年;能生产足够量的高效价和高亲和力的抗血清；通常适用于制备抗啮齿类和人蛋白质的抗体；家兔仅一型IgG而无亚型。用家兔的IgG很容易制备Fc、Fab和F(ab)2等片段,.,鸡,鸡的种系距哺乳动物较远,用以制备抗哺乳动物蛋白质的抗体具有独特的优点。鸡的IgG常称IgY,其特点是不会激活哺乳动物的补体成分C1,也不会与细菌蛋白A或蛋白质G、哺乳动物的Fc受体或类风湿因子等发生反应。在极端条件下,鸡IgY的稳定性不如家兔IgG,不过,鸡的IgY在鸡蛋内可保持稳定达数月之久,纯品IgY在中性缓冲液和冷藏条件下则可保存数年之久。用鸡IgY已经制备出Fc和单价的Fab或Fab等片段。鸡可将大量IgY输送入鸡蛋黄中,从鸡蛋中收获抗体可避免采用损伤性的收集手段。,.,免疫剂量,剂量：免疫原合适剂量的选定应考虑抗原性强弱、分子量大小和免疫时间。大动物抗原剂量（以蛋白抗原为准）约0.51mg/只，小动物约0.10.6mg/只。如无免疫佐剂可适当提高免疫剂量（10-20倍）。乳化：一般抗原与免疫佐剂体积比1:1混合。首次免疫采用完全佐剂，加强免疫采用不完全佐剂。,（1）延长抗原释放时间；（2）增加抗原的表面积；（3）佐剂能刺激吞噬细胞对抗原的处理；（4）增强辅助T细胞的作用；（5）刺激致敏淋巴细胞的分裂和浆细胞产生抗体。使无免疫原性物质变成有效的免疫原；（6）改变抗体的产生类型以及产生迟发型变态反应，并使其增强。,.,免疫方式,注射途径：免疫注射的途径也很重要。一般采用多点注射，一只动物注射总数约为810点，包括足掌及肘窝淋巴结周围，背部两侧、颌下、耳后等处皮内或皮下，皮内易引起细胞免疫反应，对提高抗体效价有利,.,免疫方式,间隔与免疫时间：第一次免疫后，因动物机体正处于识别抗原和b细胞增殖阶段，如很快接着第二次注入抗原，极易造成免疫抑制。一般以间隔1020天为好。二次以后每次的间隔一般为710天，不能太长，以防刺激变弱，抗体效价不高。免疫次数：根据抗体效价要求确定（抗血清滴度测定）,.,免疫应答,机体免疫系统受到抗原刺激后，免疫细胞发生一系列变化，并产生一定免疫效应的过程。(一)感应阶段(inductivestage)称致敏阶段(sensitizationstage)，是抗原物质进入体内，抗原递呈细胞(APC)对其识别、捕获、加工处理和递呈，以及抗原特异性淋巴细胞(T细胞和B细胞)对抗原的识别阶段。(二)增生分化阶段(proliferativeanddifferentiativestage)又称反应阶段(reactivestage)，是抗原特异性淋巴细胞识别抗原后活化，进行增殖与分化，以及产生效应性淋巴细胞和效应分子的过程。T细胞增殖分化为淋巴母细胞，最终成为效应T细胞(或称致敏T细胞)，并产生多种细胞因子；B细胞增殖分化为浆细胞，合成并分泌抗体。一部分T、B淋巴细胞在分化过程中成为记忆细胞(Bm和Tm)。在此阶段，有多种细胞间的协作和多种细胞因子的参加。(三)效应阶段(effectivestage)此阶段是由活化的效应细胞(CTL与TD或TDTH)和效应分子(抗体与细胞因子)发挥细胞免疫效应和体液免疫效应的过程。这些效应细胞和效应分子共同作用清除抗原异物。,.,.,初次应答(primaryresponse),机体初次接受适量的抗原刺激后，引起体内抗体产生的过程称为初次应答，主要特点为：机体初次接触抗原后，需经一定的潜伏期血清中才能出现抗体，潜伏期的长短取决于抗原的性质、抗原进入机体的途径、所用的佐剂类型、受体情况等，潜伏期之后为抗体的对数上升期，抗体含量直线上升，然后为持续期，抗体产生和排出相对平衡，最后为下降期；初次应答最早产生的抗体为IgM，可在几天内达到高峰，然后开始下降，接着才产生IgG，IgG抗体产生的潜伏期比IgM长，如果抗原剂量少，可能仅产生IgM，IgA产生最迟，而且含量少；初次应答产生的抗体总量较低，维持时间也短，通常以IgM为主，且抗体的平均亲和力较低。,.,再次应答(secondaryresponse),机体再次接触相同的抗原时，体内产生抗体的过程称为再次应答或回忆应答(anamnesticresponse)，主要特点为：潜伏期显著缩短，约为初次应答潜伏期的一半；抗体含量大幅度上升，比初次应答多几倍到几十倍，而且维持时间长；诱发再次应答所需的抗原剂量极小；再次应答产生的抗体主要为IgG，而IgM很少，抗体的平均亲和力高。如果再次应答间隔的时间越长，机体越倾向于只产生IgG。抗原物质如经消化道和呼吸道等粘膜途径进入机体，可诱导产生分泌型IgA，在粘膜表面发挥免疫效应。,.,血液采集,.,多克隆抗体纯化,蛋白A亲和层析蛋白A可与多种哺乳动物的IgG重链