生物化学课件(杨洋)13.rna生物合成

第十一章RNA生物合成CHAPTER11RNABIOSYNTHESIS,张晓伟(xiaoweizhang),2,rRNAs(RibosomalRNAs)75-80%：以核蛋白体的形式参与蛋白质生物合成，是蛋白质合成的场所tRNAs（TransferRNAs)10-25%：在蛋白质生物合成过程中转运氨基酸mRNAs(MessengerRNAs)2-3%：作为蛋白质合成的直接模板hnRNAs（heterogeneousnuclearRNAs）mRNA的未成熟前体snmRNAs（smallnon-messengerRNA）snRNA,siRNA，miRNA参与RNA前体的加工及基因表达调控,RNA种类及作用,3,RNA生物合成,转录（Transcription）:DNA指导的RNA合成RNA复制（RNAreplication）:RNA指导的RNA合成,4,第一节转录作用Section1Transcription,转录作用（DNA-dependentRNAsynthesis）,Transcription,在RNA聚合酶催化下，以DNA为模板，以4种三磷酸核苷（ATP,GTP,CTP,UTP）为原料进行的RNA聚合反应。,5,参与转录的物质,模板:DNA酶:RNA聚合酶(RNApolymerase,RNA-pol)原料:NTP(ATP,GTP,CTP,UTP)无机离子：Mg2，Mn2其他蛋白质因子,第一节转录体系,6,转录时DNA与RNA的碱基配对规律：,DNAAGCTRNAUCGA,一、转录模板,碱基配对的稳定性G/CA/TA/U,7,两条链都是模板吗？,DNA复制：全程复制转录：有选择性,8,DNA片段转录时，双链DNA中只有一条链作为转录的模板，这种转录方式称为不对称转录,不对称转录（asymmetrictranscription）,9,transcription,5TCAGCTCGCTGCTAATGGCC33AGTCGAGCGACGATTACCGG5,模板链（templatestrand）编码链（codingstrand）,DoublestrandofDNA,10,编码链,模板链,DNA,5.GCAGTACATGTC.33.cgtcatgtacag.5,DNA模板、转录产物mRNA和氨基酸序列之间的关系,11,53,35,模板链,编码链,编码链,模板链,结构基因,基因A,基因B,编码链和模板链是一个相对的概念：,RNA转录的不对称性,12,不对称转录的含义：,在DNA双链上，一股链可转录，另一股链不转录模板链并非永远在同一条单链上。,13,转录模板的结构特点,（一）转录单位：转录分区段进行，能够连续独立转录的一个DNA片段称为一个转录单位,14,（二）转录起始点(startsite)以+1表示，一般为A或G,上游(upstream):从转录起始点逆转录方向的区域，用负号（-）表示,下游(downstream):从转录起始点顺转录方向的区域，用正号（+）表示,15,1、启动子(promoter)：是位于转录起始点上游的一段DNA序列，是RNA聚合酶的识别和结合部位。在转录调控中起着重要作用。,（三）与转录起始和终止有关的DNA结构,16,开始转录,TTGACAAACTGT,-35区,(Pribnowbox),TATAATPuATATTAPy,-10区,原核生物启动子保守序列,RNA-pol辨认位点(recognitionsite),结合部位,17,-35区-10区+1trpTTGACAN17TTAACTN7AtRNAtrpTTTACAN16TATGATN7ALacTTTACAN17TATGTTN6ArecATTGATAN16TATAATN7AaraCTGACGN18TACTGTN6A最大一致性TTGACATATAATx/45383629402530373728412944,被RNA聚合酶保护的DNA区段碱基序列分析,18,真核生物的启动子,真核生物的三种RNA聚合酶，每一种都有自己的启动子类型。,RNA聚合酶的启动子,即mRNA基因的启动子，称类启动子,19,结构基因,-GCGC-CAAT-TATA,真核生物启动子保守序列,(cis-actingelement),20,2、终止信号（stopsignal）：在基因单位中，具有停止转录作用的部位,包括GC富集区和AT富集区,也称终止子。,(terminator),21,二RNA聚合酶RNApolymerase,22,ThediscoveryofprokaryoticRNApolymerases,SeveroOchoa,ArthurKornberg,NobelPrizeinPhysiologyorMedicine1959,fortheirdiscoveryofthemechanismsinthebiologicalsynthesisofribonucleicacidanddeoxyribonucleicacid,23,核心酶（coreenzyme）,全酶（holoenzyme）,（一）原核生物RNA聚合酶,结构:,2,2,24,36512,决定哪些基因被转录,150618,催化RNA链延伸,155613,结合DNA模板,70263,辨认起始点（转录起始后脱落）,亚基,分子量,功能,11000,功能不明,亚基数,2,1,1,1,1,原核RNA聚合酶各亚基的作用,25,RNA聚合酶全酶在转录起始区的结合,的存在保证原核生物RNA聚合酶只能与启动子区而不是其它区域形成稳定的二元复合物。,26,1.识别转录起始点2.促使DNA双链打开17bp3.催化NTP以3,5磷酸二酯键相连，方向534.识别转录终止信号,原核RNA聚合酶具有多种功能,27,原核RNA聚合酶作用特点：,1.聚合速率慢，3085nt/s（DNA合成250-1000nt/s）,2.缺乏35外切酶活性，无校对功能，错误率高（10-410-5，DNA合成错误率10-910-10）,4.活性可被利福霉素抑制（与亚基结合）,利福霉素抗结核,3.不同的识别不同的启动子,28,（二）真核生物的RNA聚合酶,5.8SrRNA18SrRNA28SrRNA,mRNA,tRNA5SrRNAsnRNA,最终转录产物,29,NobelPrizeinChemistry2006,RogerD.Kornberg,Forhisstudiesofthemolecularbasisofeukaryotictranscription,FatherandSon,30,第二节转录过程Section2TranscriptionProcess,转录过程可以分为三个阶段：,1.转录起始（Initiation）2.转录延长（Elongation）3.转录终止（Termination）,一原核生物的转录过程二真核生物的转录过程,31,1.转录起始（Initiation）,一原核生物的转录过程,RNA聚合酶必须准确结合转录模板的起始区域DNA双链解开，使其中的一条链作为转录的模板,?,转录起始需解决两个问题,RNA聚合酶-识别DNA启动子(35区),核心酶与启动子结合(10区),DNA构象改变，启动子10区处打开双链DNA分子（约17bp),转录起始过程,DNA构象改变，启动子10区处打开双链DNA分子（约17bp),转录开始，形成第一个3,5磷酸二酯键（不需引物）,核心酶沿模板向下游移动,（循环使用）,34,1、转录不需要引物，RNA聚合酶结合于转录起始部位可直接合成RNA。,3、因子必须脱落，否则核心酶不滑动，RNA链不能延长。,转录起始特点：,2、RNA聚合酶可挤入DNA双链间，不需其它酶来解旋、解链。,35,核心酶沿DNA模板链向下游方向滑动,核心酶滑过的部位，DNA链很快恢复双螺旋结构,RNA链延长，暂时形成DNARNA杂交体（约8bp）,RNA逐步脱离模板链,2.转录延长（Elongation）,36,转录泡(transcriptionbubble)由DNA双链（打开约17bp）,RNA聚合酶与新合成的RNA链局部形成的结构.,37,原核生物转录过程中的羽毛状现象,38,3.转录终止（Termination）,核心酶遇到DNA模板的终止信号,核心酶不能继续滑动,核心酶从模板DNA上脱落,新合成的RNA链脱落，转录终止,39,终止信号（stopsignal）：在基因单位中，具有停止转录作用的部位,包括GC富集区和AT富集区,也称终止子。,不依赖因子依赖因子,原核转录终止方式：,(terminator),40,两类终止子有共同的序列特征：在转录终止点之前有一段间断的回文结构。,41,转录方向,3,3,5,TCGGGCGAGCCCGC,CGCCCGAGCGGGCT,AAAAAATTTTTT,3,3,5,5,DNA,模板链,编码链,AAAAAAUUUUUU,5,TTTTTT,DNA,模板链,编码链,转录产物,3,不依赖因子的终止子,42,转录方向,3,3,5,TAAGTAGATTCATC,CTACTTAGATGAAT,AGCTACTCGATG,3,3,5,5,DNA,模板链,编码链,AGCTACUCGAUG,5,TCGATG,DNA,模板链,编码链,转录产物,3,依赖因子的终止子,43,辅助识别终止信号诱使RNA聚合酶构象改变具有解螺旋酶活性，释放RNA产物,因子（6聚体蛋白质）：,原核生物转录过程,45,多顺反子(Polycistronic)：一个结构基因转录生成一个mRNA，编码多条多肽链,46,二真核生物的转录过程,1.转录起始（Initiation）,起始过程比原核生物复杂,上游调控序列复杂启动子Promoter增强子Enhancer、静息子Silencer等,RNA聚合酶不直接与模板结合转录前起始复合物pre-initiationcomplex,PIC需多种转录因子参与,47,转录起始点上游区段,编码链,模板链,其他调节元件,增强子（+）静息子（-）,CCAAT,TATA,基因转录区,5,3,调节表达,基础表达（启动子）,转录起始点,+1,-40-110-25,3,5,基因调控区,mRNA,顺式作用元件(cis-actingelement),48,反式作用因子（trans-actingfactor）,能直接或间接识别和结合顺式作用元件的蛋白质，叫反式作用因子，也叫转录因子（transcriptionalfactor,TF)；其中直接或间接结合RNA聚合酶，为PIC装配所必需的，又叫通用转录因子（generalTF)，或基本转录因子（basalTF)。,49,由RNA-Pol催化转录的PIC,TFD-A-B-DNA复合物,A,B,TATA,H,E,PIC组装完成，TFH使CTD磷酸化(CTD:RNApolII大亚基carboxyl-terminaldomain),50,RNA-polII大亚基CTD磷酸化,TFIIH具有蛋白激酶活性,RNA聚合酶向下游移动,转录延长,51,2.转录延长（Elongation）,真核生物RNA-pol前移会遇上核小体,52,5-AAUAAA-,5-AAUAAA-,核酸酶,-GUGUGUG,RNA-pol,AATAAAGTGTGTG,转录终止的修饰点,5,5,3,3,3加尾,AAAAAAA3mRNA,（三）转录终止,和转录后修饰密切相关。,53,单顺反子(monocistronic),一个结构基因转录生成一个mRNA，编码一条多肽链。,54,第三节转录后的加工过程Section3RNAProcessing,剪切(cleavage)和剪接(splicing)末端添加(terminaladdition)核苷酸化学修饰(modification)RNA编辑(RNAediting),将转录生成的前体RNA转变为成熟的、有活性的RNA的过程,主要加工方式：,55,一mRNA前体的加工,（一）mRNA生成特点（原核&真核）,ProcessingofmRNAsPrecursor,原核生物：多顺反子mRNA(polycistronicmRNA)没有核膜，转录和翻译同时进行不需复杂加工就表现出生物活性真核生物：单顺反子mRNA(monocistronicmRNA)转录生成的是mRNA前体hnRNA需要在细胞核加工成成熟的mRNA,56,5末端加帽(5cap)3末端加尾剪接作用甲基化修饰核苷酸编辑,（二）真核生物mRNA前体的加工,(3polyAtail),57,5末端帽子的结构:m7GpppNmp-,7甲基鸟嘌呤7methylguanylate55的连接5to5linkage核糖2位羟基甲基化methylationof2carbon,58,5pppNp,5GpppNp,pppG,ppi,鸟苷酸转移酶,5m7GpppNmp,甲基转移酶,CH3-,5ppNp,磷酸酶,Pi,5末端帽子的生成:,G/A,CH3,59,5末端帽子的功能:m7GpppNmp-,保护新合成的mRNA免被降解参与第一个内含子的剪接协助mRNA转移至胞浆协助mRNA在核糖体的准确定位,60,3末端多聚A“尾”的生成,3polyadenylation,G-Trich,转录终止修饰点,61,3末端加多聚A“尾”：,增加mRNA的稳定性参与最后一个内含子的剪接,功能：,62,（三）mRNA的剪接（mRNAsplicing）,除去hnRNA中的内含子，连接外显子。,英国科学家，因发现断裂基因于1993年获诺贝尔奖,美国科学家，因发现mRNA的剪接于1993年获诺贝尔奖,63,真核生物的基因是一种断裂基因，由编码区和非编码区组成。外显子与内含子相间排列,64,外显子(exon)：在断裂基因及初级转录产物中出现，并表达为成熟RNA的核酸序列。内含子(intron)：隔断基因的线性表达，在剪接过程中被去除的核酸序列。,DNA转录hnRNA加工mRNA,(结构基因),(内含子、外显子),(只有外显子),mRNA,Exon1,Exon2,Exon3,Intron1,Intron2,蛋白质,DNA,65,剪接作用（mRNAsplicing）,剪切hnRNA中内含子序列，将各外显子序列连接为成熟mRNA的过程。,66,67,套索(lariat)的形成及剪除,68,剪接体参与mRNA前体的剪接,（spliceosome）,剪接体:UsnRNP与mRNA前体结合形成的复合物,分类：U1，U2，U4，U5，U6,69,鸡卵清蛋白基因,hnRNA,首、尾修饰,hnRNA剪接,成熟的mRNA,鸡卵清蛋白基因及其转录、转录后加工,70,鸡卵清蛋白成熟mRNA与DNA杂交电镜图,DNA,mRNA,71,同一个初级转录本，在不同组织中由于剪接作用的差异，可产生不同的成熟mRNA，导致翻译生成不同的蛋白质产物。,可变剪接（AlternatesplicingofmRNA）,72,Alternativeprocessingofthecalcitoningenetranscript,73,RNA编辑（RNAediting）,遗传信息在RNA水平发生改变，由一个基因产生不止一种蛋白质的加工方式。,核苷酸插入、删除或替换,C,脱氨,U,74,甲基化作用（Methylation）,甲基化位点,真核生物mRNA分子中含甲基化核苷酸hnRNA5端帽子结构非编码区分子含12个m6A,需供体SAM和甲基转移酶参与,75,二tRNA前体的加工,ProcessingoftRNAsPrecursor,剪接和剪切3末端添加-CCA碱基修饰,76,剪切（cleavage）RNaseP切除5端多余的核苷酸RNaseD切除3端多余的核苷酸,剪接（splicing）:去除内含子序列,77,3末端添加-CCA,核苷酸转移酶,ATP,ADP,78,碱基修饰,79,三rRNA前体的加工,ProcessingofrRNAsPrecursor,剪接甲基化修饰,rRNA基因多拷贝，串联在DNA分子中,细菌：5-10拷贝果蝇：260拷贝人：1100拷贝,80,Prokaryonic30SrRNAprecursor,P16S,P23S,P5S,Pt,Pt,5,3,RNase,RNase,rRNA,rRNA,rRNA,tRNA,tRNA,(一)原核核糖体RNA的加工,81,(二)真核核糖体RNA的加工,82,第三节核酶Section3RIBOZYMES,具有催化活性的RNA,核酶ribozyme,核糖核酸酶RNase,水解核糖核酸链，化学本质是蛋白质,83,T.Cech等首先发现四膜虫rRNA前体具有自我剪接作用(1982),核酶的发现,S.Altman发现RNaseP中的RNA可催化tRNA的加工(1983),1989年诺贝尔化学奖,84,核酶类