分子克隆工具酶及其应用

分子克隆工具酶及其应用,分子克隆工具酶及其应用,限制性内切酶主要用于DNA分子的特异切割DNA甲基化酶用于DNA分子的甲基化核酸酶用于DNA和RNA的非特异性切割核酸聚合酶用于DNA和RNA的合成核酸连接酶用于DNA和RNA的连接核酸末端修饰酶用于DNA和RNA的末端修饰其它酶类-用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。,第一节限制性内切核酸酶,一.限制性内切酶的发现1.细菌限制修饰系统的发现WernerArber于1962-1968年发现，1968年分离到I型限制酶。2.限制酶HindII的发现HOSmith和Wilox于1970年首次从流感嗜血杆菌（H.influenzae）中发现并分离到HindII限制酶。3.SV40限制图谱和转录图谱的绘制D.Nathans（1971年）用HindII绘制SV40的限制酶谱。,二.限制修饰系统的种类1.I型：由三个基因构成，hsdR；hsdM；hsdS（hostspecificityforDNArestrictionmodificationandspecificity）位于染色体上，三个基因构成一个复合体，限制酶需要ATP、Mg2+、SAM（腺苷甲硫氨酸）。2.II型：限制与修饰基因产物独立起作用，在.coli中这两种基因位于质粒上。3.III型：修饰酶与型酶相同，hsd与hsd基因产物结合成一亚单位，限制酶是独立存在的。上述三个系统中，只有II型限制酶与甲基化酶具有相当高的核苷酸识别特异性，因而被广泛用于基因工程中。,三.限制性内切酶的定义、命名1.定义：广义指上述三个系统中的限制酶；狭义指II型限制酶。2.命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。例如：Hind前三个字母来自于菌种名称H.influenzae，“”表示菌系为型血清型；“”表示分离到的第三个限制酶。EcoRIEscherichiacoliRIHindHaemophilusinfluensaedSacI(II)StreptomycesachromagenesI(),四限制酶的特点1.识别顺序和酶切位点）识别-8个相连的核苷酸MboINGATCN；AvaIIGG(A/T)CCBamHIGGATCC：PpuMIPuGG(A/T)CCPyNotIGCGGCCGC；SfiIGGCCNNNNNGGCCCCGGNNNNNCCGGFokI5-()9-33-()13-5外侧，产生-端突起）富含,）对称性双对称EcoRI5-GAATTC-33-CTTAAG-5）切点大多数在识别顺序之内，也有例外）限制酶切后产生两个末端，末端结构是-和-2.末端种类）-端突起，个数为或个核苷酸PstI5-CTGCAG-35-CTGCAG-33-GACGTC-53-GACGTC-5）-端突起，个数为或个核苷酸EcoRI5-GAATTC-35-GOHPAATTC-33-CTTAAG-53-CTTAAPHOG-5,）平齐末端SmaI5-CCCGGG-35-CCCGGG-33-GGGCCC-53-GGGCCC-5）非互补的粘性末端）切点在识别顺序之外的，如：FokIFokI5-GGATG()9-35-GGATG(N)93-CCTAC()13-53-CCTAC(N)13）能识别简并顺序的，如：AvaIAvaI5-CPyCGPuG-3CCCGGG;CTCGGG;CCCGAG;CTCGAG,）相容性末端如：BamHIGGATCCBglIIAGATCTMboI,Sau3AINGATCN上述几种限制酶产生的DNA片段仍可相连，由此形成的重组分子能被MboI和Sau3AI识别和酶切，但BamHI和BglII的识别机率只有1/16。BamHI+MboIA/C/G/TGATCT/C/G/ABamHI和BglII(AGATCT)两种酶产生的相容性末端，相连后不能为两种酶所识别和酶切。BamHI+BglIIA/GGATCT/C不同末端的连接特性:除第4种末端不能进行不同DNA分子或同种DNA分子不同切点产生的末端相连外，其余4种末端可以相互连接。,五.异源同序酶（isoschizomer，同裂酶）1.定义：能识别相同序列但来源不同的两种或多种限制酶2.特点：1）识别相同顺序2）切割位点的异同KpnIGGTACCAsp718GGTACCSstICCGCGGSacICCGCGG限制酶的星反应（staractivity）1.特点:限制酶识别序列特异性降低2.发生星反应的限制酶和条件（见下页）3.星反应的利用和避免,表1具有星反应的限制性内切酶与条件限制酶诱发星活性的条件a识别序列AvaI1,2,4BamHI1-5,8GGATCN,GPuATCCBstI2,4BsuI2,4,6EcoRI1,2,4-6NAATTNHae2,4HhaI2,4,7Hind6HpaI1,2,4PstI1,2,4,7Pvu2,4SalI1,2,4,7ScaI4-6,8Sst2,4XbaI2,4,7a.1：亚乙二醇(45%)；2:甘油(12%)；3：乙醇(12%)；4：高酶/DNA比(25U/g)；5：Mn+代替Mg+；6:pH8.5;7:二甲基亚砜(8%);8:无NaCl。,七.其它特异性的内切酶及其用途1.末端酶（terminase）：5-GGGCGGCGACCTN-3N-5，出现的频率约412分子量为117,000=1A（74,000）+2Nul（21,000）2.Omega核酸酶（I-SceI）：由内含子编码，用于rRNA的剪切，出现的频率约418=6.9X1010bp，其识别顺序为5-TAGGGATAACAGGGTAAT-3TATT3.I-PpoI：来自于Physarumpolycephalum识别序列：CTCTCTTAAGGTAGCAATT4.用途遗传标记，构建载体,八.限制酶的用途1.DNA重组2.限制酶（物理）图谱绘制3.突变分析（RFLP分析）4.限制酶的部分酶切与完全酶切附：IIS型限制酶的特点1.具有特异型核苷酸顺序识别能力，但该顺序不具有对称结构。2.酶切位点与识别位点不一致，切点常在识别位点的一侧，1-20nt。3.酶切后的末端经补平后又可发生酶切反应。4.产生粘性末端可以是1-5个核苷酸。5.均为单体，分子量为47108kD。,第二节DNA甲基化酶,一.甲基化酶的种类与识别顺序1.限制修饰系统I、II、III型中的甲基化酶三个系统中的甲基化酶可使细菌DNA分子中的胞嘧啶和腺嘌呤发生甲基化，形成5-甲基胞嘧啶和6-甲基腺嘌呤：在DNA重组实验中，常用的甲基化酶属于II型，它与相应的限制酶的识别顺序相同，其甲基化位点与限制酶作用位点可同可不同。如：M.EcoRIGAmATTCCEcoRIGAATTC不同MHpaICmCGGHpaICCGG相同,2.Ecoli的dam、dcm甲基化酶这类甲基化酶与限制酶无关，不构成相应的限制修饰系统。damGmATC，dcmCmCA/TGG3.哺乳动物的甲基化酶该酶可使CG中的胞嘧啶甲基化，其甲基化反应与DNA复制、基因转录等过程有关。4.Ecoli中依赖于甲基化的限制修饰系统mrr（mA/A）、mcr(Am5CG)、merB（Pum5C）,二.甲基化酶活性对限制酶活性的影响1.dcm和dam甲基化酶对限制酶的影响1）抑制某些限制酶的活性，不管两种限制酶的识别顺序是完全重叠还是边界重叠如：完全重叠BclIdam(GATC)；ScrFIdcm(CCA/TGG)边界重叠ClaI-dam；Sau96I-dcm2）不能抑制某些限制酶活性，不管两者的识别顺序为何种重叠如：dam-BamHI，Sau3AI，BglII，PvuI；dcm-BstNI,表2对甲基化敏感的限制性内切酶限制酶识别序列*甲基化酶AvaGG(A/T)CC(A/T)GGdcmBclTGATCAdamClaGATCGATdamEcoRCC(A/T)GGdcmHphGGTGATCdamMboGATCdamNruGATCGCGAdamSau96GGNCC(A/T)GGdcmSauFCC(A/T)GGdcmStuAGGCCTGGdcmTagGATCGAdamXbaTCTAGATCdam*下横线字母表示限制酶识别序列,绿色字母表示dam甲基化酶识别序列,红色字母表示dcm甲基化酶识别序列,2.II型甲基化酶对限制酶活性的影响）抑制同种限制酶的活性M.BamHIGGATmCCBamHI(GGATCC)M.EcoRIGAmATTCEcoRI(GAATTC)）抑制不同种限制酶的活性a.顺序完全重叠如：M.ClaI（ATCGmAT）-TaqI（TCGmA）b.顺序边界重叠如：M.BamHI（GGATmCC）-MepI（mCCGG）抑制不同种限制酶的部分活性MTaqI（TCGmA）-HindII（GTPyPuAC）：GTCAAC，GTTAAC，GTCGmAC，GTTGAC3.甲基化酶的用途）改变某些限制酶识别顺序的特异性，以便重组体的形成）在建立基因文库时，可先使DNA分子部分甲基化，然后再用限制酶切,表3甲基化酶与识别序列甲基化酶识别序列a受甲基化影响的限制酶bM.AluAGmCTAlu,BamH,Bsp1286Dde,HgiA,Nhe,PstM.BamHGGATmCCBamH,MspM.ClaATCGmATCla,Mbo,TaqdamGmATCcdcmCCA/TGGcM.EcoRGAmATTCEcoRM.HIdGCNGCGGmCCMst,Pst,PvuM.HaeGGmCCBan,Bgl,Bsp1286,BstX,Hae,Msp,Nae,Nco,Sac,Sau96M.HhaGmCGCAha,FnuD,HhaM.HpaCmCGGAha,Ava,Ava,Hpa,ScrFM.HphTmCACCHinf,Hph,Sau3AM.MspmCCGGBamH,MspM.PstCTGCmAGAlu,PstM.TaqTCGmAAluI,Ava,EcoRV,HinC,Hinf,Mbo,Taq,Xmna.标在碱基的左上角的m表示该碱基被甲基化;b.所列出的限制酶均已商品化;c.参见表2;d.M.HI分离自噬菌体污染的细菌细胞，它可识别两个序列，GCNGC的甲基化位点尚未确定。,第三节核酸酶,ds-DNA结构:切口,缺口,断口,一.外切酶III（ExoIII）1.一般特点：来自于E.coli，分子量28,000kD2.催化反应类型1)外切酶活性：35，产生5-单磷酸核苷酸和具各种结构的ds-DNA，pH7.6-8.52)核酸酶H活性：除去DNA-RNA杂交分子中的RNA分子，pH7.6-8.53)3-磷酸酶活性：除去3-磷酸基后形成3-OH端，有利于DNA聚合酶反应，pH6.8-7.44)内切酶活性：在无嘌呤或无嘧啶处将DNA键切开，pH7.6-8.5,3.外切酶活性特点1)反应底物：互补ds-DNA2)碱基释放速度：CA-TG3)反应产物：5-单磷酸核苷和具缺口或5-端突起的ds-DNA，过度反应将导致DNA降解4.用途1)核酸（DNA）标记2)基因突变-缺失3)DNA序列测定时作顺序缺失5.使用注意事项1)正式使用前，测定在一定条件下酶的反应速度2)在一定条件下，ExoIII不能作用GC富集区(来自于cDNA加尾),ExoIII的外切酶和RNaseH的作用,二.外切酶1.反应特点1)作用底物:要求5-PO4基;不作用含切口的DNA分子2)作用方向与产物：53;产生5-P核苷和3-突起的ds-DNA2.用途：DNA定序测定;除去5-端突起，产生3-端突起，便于加尾,三.核酸酶Bal311.一般特点：胞外酶；具DNase和RNase活性；由“快”和“慢”两种成分构成2.催化反应特点1)底物：ss-DNA，ds-DNA，RNA(外切与内切活性)2)作用方向与产物：53和35同时进行，但反应速度不同；产生5-单磷酸核苷和缩短的ds-DNA3.用途：基因突变-缺失;绘制限制酶谱;DNA定序(与ExoIII相同)，其优点是Bal31酶活依赖于Ca+和Mg+，Ca+在反应完毕后可用EGTA（乙二醇四乙酸）灭活而不影响Mg+浓度，后者是限制酶活性必需的4.使用注意事项：1)应作预备实验，因每批酶制品的“快”“慢”酶含量不同2)DNA两条链碱基组成不同，终止反应时存在单链突起，需要补平,核酸酶Bal31的活性,四.核酸酶S11.一般特点：糖蛋白(含糖量8%)，最佳pH4.5，对热稳定，抗变性剂2.催化反应类型:ss-DNA;ss-RNA;双螺旋变性区3.用途1)基因突变-缺失，常与外切酶，如ExoIII、外切酶、Bal31连用2)DNA定序分析3)S1作图法4)基因结构分析5)tRNA结构分析4.使用注意事项1)避免长时间反应，因最适酸性pH将导致DNA断裂或降解2)避免使用高浓度酶量，以免DNA被降解(因产生切口),核酸酶S1活性,五.绿豆核酸酶1.与S1酶相同点：作用于ss-DNA和RNA，对5-端的突起核苷酸作用速度为GCAT2.与S1酶的不同点最适pH接近中性，不会产生切口;不使具切口的ds-DNA断裂3.用途：与S1酶相同六.外切酶作用于ss-DNA的3-与5-端，产物为低聚核苷酸除去单链DNA形成平整末端七.牛脾磷酸二酯酶作用含5-羟基端的ss-DNA和RNA，产生3-单磷酸核苷用于短链RNA和DNA的定序分析,八.蛇毒磷酸二酯酶作用3-羟基单、双链DNA和RNA，产生5-单磷酸核苷用于RNA和DNA的定序分析表4几种常用外切酶的特点外切酶作用方向作用底物反应产物ExoIII35dsDNA单核苷酸外切酶53ss和dsDNA同上Bal3135和53ss和dsDNA,RNA同上S135和53ssRNA和ssDNA低、核苷酸绿豆核酸酶35和53ssRNA和ssDNA同上ExoVII35和53ssDNA低聚核苷酸牛脾磷酸二酯酶53ssRNA，ssDNA同上蛇毒磷酸二酯酶35ss，dsRNA和DNA同上,九.RNase大部分用于RNA的核苷酸序列分析或除去DNA样品或蛋白质合成系统中的RNA分子。RNase的识别序列和特点见表5。1.RNaseA分离自牛胰脏，对热稳定，抗去污剂（100加热15min仍具活性）,用于除去DNA样品中的RNA分子2.核酸酶S7，亦称微球菌核酸酶，对RNA敏感，用于除去蛋白质合成系统中的内源mRNA十.RNaseH作用于DNA-RNA杂交分子中的RNA链，用于cDNA文库建立时除去DNA链以便第二条链cDNA链的合成。,表5核糖核酸酶反应特点核酸酶特异性反应核酸酶特异性反应APyp/NPhyMAp/N或Up/NCL3Cp/N,Ap/N和Cp/NB.cereusCp/N,Up/NT1Gp/NP1无特异性反应T2无特异性反应S7Np/A和Np/UU2Pup/N或Ap/NPhy1Ap/N,Gp/N和Up/N,十一.DNaseI1.特点：具内切酶活性，作用于ds-DNA，但无核苷酸序列特异型，产生5-P低聚核苷酸;Ca2+,Mg2+或Ca2+,Mn2+可使酶活达最大值当酶浓度很低时，ds-DNA分子上将形成切口，不同类型二价阳离子对两条链上切口位置形成有以下影响：Mg2+存在时，两条链上的切口独立无关Mn2+存在时，两条链上的切口几乎在同一位置2.用途1)切口移位，制备DNA探针2)制备RNA样品时除去DNA分子3)基因突变时产生切口,第四节DNA聚合酶,一.E.coliDNA聚合酶I（polI）1.E.coli的DNA聚合酶系统PolI参与DNA修复,具35和53外切酶活性polII同上具35外切酶活性polIII参与DNA复制,具35和53外切酶活性2.E.colipolI的特点1）具两种外切酶活性和DNA聚合酶活性，在蛋白酶作用下，该酶分裂成两个大小不同的片段，其中小片段具53外切酶活性，大片段具35外切酶活性(大片段亦称为Klenow片段,polIK)2）聚合酶活性，53,要求3-OH引物和模板DNA，其延续性受反应条件的影响（表6）3）外切酶活性,3.用途1）除去3-端突起的单链DNA（在无dNTP时）2）补齐5-突起端3）合成第二条cDNA4）切口移位制备探针其中用途2)和3)常用大片段表6E.coliDNAPolI的延续性DNA模板-引物类型反应条件延续性(碱基数)切口ColE137C,低盐8缺口ColE137C,低盐47切口/缺口胸腺DNA37C,低盐24polyd(AT)37C,低盐188polyd(AT)5C,低盐14polyd(AT)5C,高盐3,二.T4DNA聚合酶1.特点：53聚合酶活性，1500nt/min,为polI的两倍35外切酶活性，可作用于ss-DNA和dsDNA,其切除速度分别为40和4000nt/min2.用途：制备高比活性探针(1010cpm/gDNA);DNA末端修饰-缺失,三.反转录酶1.AMV反转录酶1）结构与酶活性反转录酶以，形式存在，其中（无活性）P32（内切酶活性）+聚合酶+P24（RNaseH活性），各步反应由蛋白酶催化2）聚合酶活性a.RNA，DNA引物（大于8nt）cDNA链bDNA-RNA引物互补DNA链c(rA)1100(dT)12-18(dT)nor(rc)n.dGn(dG)n,反转录酶的结构和活性,5AAAAA3引物5AAAAA3,2.M-MLV反转录酶1)特点：不具内切酶活性;RNaseH活性低;稳定性差2)与AMV反转录酶比较a合成短链cDNA(0.6kb)时，两者相同，但M-MLV反转录酶需要量大，可能与其稳定性差有关b合成长链cDNA(4.5-7.5kb)时，它比AMV反转录酶有效得多，这与它无内切酶活性有关。3)用途a.cDNA合成用于文库建立;b.制备cDNA探针;c.DNA序列分析;d.填补5-突起末端以获平端,四.TaqDNA聚合酶1.特点：分离自水生栖热菌，分子量为94,000，最适反应温度75，对95高温具良好稳定性，该酶不存在35外切酶活性2.用途：主要用于DNA的体外扩增，经25次循环后才进入酶的反应稳定期，一个DNA分子因而可被扩增4106倍DNA扩增技术又称为聚合酶链式反应，它包括以下三个步骤：DNA模板变性(95)与DNA引物退火(45)引物延伸(75),TaqPol和PCR,五.DNA定序酶用基因工程方法去除35外切酶活性的TaqDNA聚合酶六.TthDNA聚合酶93kD，75，含有二级结构DNA分子的定序七.TliDNA聚合酶100仍具酶活，35外切酶活性，85kDDNA的切平反应和补平反应DNA聚合酶和核酸酶S1或绿豆核酸酶连用,可用于DNA末端结构的修饰,切平反应和补平反应,四种不同补平反应,5-GGATCC-3BamHI5-GGATCC-33-CCTAGG-53-CCTAGG-5dNTPdGTPdGTP/dATPdGTP/dATP/dTTP5-GGATC5-GG5-GGA5-GGAT3-CCTAG3-CCTAG3-CCTAG3-CCTAGGATCC-3GATCC-3GATCC-3GATCC-3CTAGG-5GG-5AGG-5TAGG-5IS1S1S15-GGCC-35-GGATCC-35-GGATATCC-33-CCGG-53-CCTAGG-53-CCTATAGG-5IIIII,第五节RNA聚合酶,一.SP6RNA聚合酶1、特点：依赖于DNA的RNA聚合酶，具SP6启动子特异型2、用途：主要用于RNA分子的体外合成，RNA分子可用于：1）RNA分子的拼接研究2）标记的RNA常用于杂交，RNA-DNA比DNA-DNA分子更稳定，两条链均可标记，产生的RNA具高放射比活性3）DNA的定序分析4）基因结构的研究，其中包括内含子数目，长度和位置5）还可以用于蛋白质的合成研究,RNA聚合酶活性,二.T7RNA聚合酶特异性识别T7噬菌体基因启动子三.T3RNA聚合酶特异性识别T3噬菌体基因启动子基因启动子识别的特异性比较：SP6T7T3四.E.coliRNA聚合酶五.多聚核苷酸磷酸化酶,第六节连接酶,一.T4DNA连接酶1.特点：只连接ds-DNA分子，要求3-羟基和5-磷酸基2.用途：1)相同或相容粘性末端的连接2)平整末端的相连DNA平端来源：限制酶作用结果;限制酶与其它酶共同作用结果。平端的连接比粘性末端的连接要困难得多，所需的酶量也多3.抑制剂：PO43-5mM,NaCl25mM,Ca+0.1mM,5-AAGCTT-35-AOHPAGCTT-3PAGCTTAOH3-TTCGAA-53-TTCGAPHOA-5HOATTCGAP退火5-AHOPAGCTTAHOPAGCTT-33-TTCGAPOHATTCGAPOHA-5或5-AHOPAGCTTAHOPAGCTT-33-TTCGAPOHATTCGAPOHA-5T4DNA连接酶5-AAGCTTAAGCTT-33-TTCGAATTCGAA-5或5-AAGCTTAAGCTT-33-TTCGAATTCGAA-5,T4DNA连接酶的连接反应(两种插入方向),+,二.E.coliDNA连接酶只能连接具粘性末端DNA分子，以NAD作辅助因子三.T4RNA连接酶参与单链RNA分子的连接。主要用于提高T4DNA连接酶在连接反应中的连接效率（20倍）,HOPHOPHOP,535353,RNA连接酶活性,第七节核酸末端修饰酶,一.细菌碱性磷酸酶（BAP）1.特点1)除去ss-DNA，ds-DNA和RNA分子两端的3-和5-磷酸基2)对热稳定2.用途1)载体DNA的去磷酸化，防止自我连接，以增加重组频率2)核酸末端标记二.牛小肠碱性磷酸酶（CIP）与BAP相同，只是CIP对热敏感,磷酸酶(I)与磷酸激酶(II)活性,磷酸激酶的交换反应,三.T4多聚核苷酸激酶1.催化反应类型1)激酶活性（5-磷酸化酶）：可将ATP中的位的磷酸基转移到ss-DNA，ds-DNA和RNA分子的5-羟基端，在这反应过程中可有两种方式进行（pH7.5-8）.转移反应；.交换反应2)3-磷酸酶活性（pH5-6）2.用途1)5-端末端标记2)分子克隆过程中以获得5-磷酸基末端，便于连接酶反应,四.末端转移酶（TdT）1.反应特点底物：dNTP及衍生物，3个核苷酸，要求3-OH端，需要ss-DNA作为引物，以3-突起端的ds-DNA为最高，亦可用于ds-DNA加尾2.核苷酸掺入速度二甲基砷酸盐缓冲液和Mg2+可提高嘌呤核苷酸的掺入速度，而Ca2+可提高嘧啶掺入速度3.用途3-加尾，便于两DNA分子重组;3-末端标记,五.多聚腺嘌呤聚合酶该酶是在RNA分子的3-端（OH）加上一个多聚A的尾巴，其用途可标记RNA和加尾的RNA，可用于cDNA的合成六.烟草酸性焦磷酸酶可除去mRNA帽子结构中的焦磷酸:m7Gp-p-p-Xp-Yp-mRNAp-Xp-Yp-mRNA七.鸟苷酸转移酶1.催化类型RNA三磷酸酶:pppN(pN)nppN(pN)n+Pi鸟苷酸转移酶:-32PGTP+ppN(pN)nG32pppN(pN)n+PPiRNA甲基转移酶:AdoMet+G(5)pppN(pN)nm7G(5)pppN(pN)n+AdoHCy2.用途：标记DNA,第八节其它酶类,1.原生质体的制备酶类制备原生质体目的：外源DNA导入；核酸和蛋白质的提取溶菌酶，zymolyase，glusulase，NovoZyme，溶壁酶，纤维素酶2.蛋白质降解酶类蛋白酶K3.检测酶类抗生蛋白链素-半乳糖苷酶,碱性磷酸酶,辣根过氧化物酶,练习题,1.一种DNA分子经三种限制酶完全酶切后得如下结果：EcoRI5kbEcoRI/HindIII1、2、3、4kbHindIII3kb、7kbEcoRI/PstI2、3、5kbPstI10kbHindIII/PstI1、3、6kb将各限制酶位点绘制在DNA分子上。2.另一DNA分子经相同处理后得如下结果，将各限制酶位点标在DNA分子上。EcoRI1、3、6kbEcoRI/HindIII1、3kbHindIII4、6kbEcoRI/PstI1、3、5kbPstI2、8kbHindIII/PstI2、6kb3.下图中的一段DNA分子上有两个限制酶PstI和EcoRI识别位点，两位点相距10bp，现有一研究生要分析EcoRI右侧500bp区域内的功能，他需要在这一区域内获得各种缺失突变体以确定某功能区，他应如何设计此实验？假定EcoRIPstI间的10bp除去后并不影响任何结果分析，但PstI位点左侧的DNA不能除去,4.假如PstI位点为另一限制酶HindIII，实验又该如何设计？5.现有一研究者打算将一EcoRIDNA片段克隆到另一个DNA分子的BamHI位点以便DNA扩增，但扩增后的DNA分子又可用BamHI限制酶将插入的片段回收，如何设计此实验。6.一研究生要将一质粒（pI）上的B