《色谱新技术》PPT课件

第一节、毛细管色谱,第二章色谱法的新技术,1.毛细管色谱柱的结构特点,（1）不装填料阻力小，长度可达百米的毛细管柱，管径0.2mm。（2）气流单途径通过柱子，消除了组分在柱中的涡流扩散。（3）固定液直接涂在管壁上，总柱内壁面积较大,涂层很薄，则气相和液相传质阻力大大降低。（4）毛细管色谱柱柱效高达每米30004000块理论塔板，一支长度100米的毛细管柱，总的理论塔板数可达104106。,2.毛细管色谱分离能力提高的途径(1)由塔板理论：增加柱长减小柱径，即增加柱子塔板数；(2)由速率理论：减小组分在柱中的涡流扩散和传质阻力，也即降低塔板高度,3.毛细管色谱具有的优点,（1）分离效率高：比填充柱高10100倍；（2）分析速度快：用毛细管色谱分析比用填充柱色谱速度（3）色谱峰窄、峰形对称。（4）灵敏度高，一般采用氢焰检测器。（5）涡流扩散为零。,4.毛细管色谱的种类与制备方法,毛细管柱按其制备方法可分为以下几种：涂壁开管柱（wallcoatedopentubular，WCOT柱）：将固定液直接涂敷在管内壁上。柱制作相对简单，但柱制备的重现性差、寿命短。多孔层开管柱（porouslayeropentubular，PLOT柱）：在管壁上涂敷一层多孔性吸附剂固体微粒。构成毛细管气固色谱。载体涂渍开管柱（supportcoatedopentubular，SCOT柱）：将非常细的担体微粒粘接在管壁上，再涂固定液。柱效较WCOT柱高。化学键合或交联柱：将固定液通过化学反应键合在管壁上或交联在一起。使柱效和柱寿命进一步提高。,5.毛细管色谱实验技术,毛细管柱内径很细，因而带来三个问题：（1）允许通过的载气流量很小。（2）柱容量很小，允许的进样量小。需采用分流技术，（3）分流后，柱后流出的试样组分量少、流速慢。解决方法：灵敏度高的氢焰检测器，采用尾吹技术。,分流比：放空的试样量与进入毛细管柱的试样量之比。一般在50：1到500：1之间调节。,1.基本原理及方法,基本原理：在一定条件下，高分子及非挥发性有机化合物遵循一定的裂解规律，即特定的样品能够产生特征的裂解产物及产物分布，采用气相色谱分析、鉴定裂解产物，据此可对原样品进行表征。方法：样品置于裂解器中，在严格控制的条件下，快速加热，使之迅速分解成为可挥发的小分子产物，然后直接将裂解产物送入色谱柱中进行分离，获得定性定量数据。,第二节、裂解气相色谱的原理与应用,特点:,(1)分离效率高(色谱法自身的特点)(2)灵敏度高(色谱法自身的特点)(3)分析速度快快速裂解、快速分析；不丢失信息；(4)信息量大裂解条件与裂解产物关系；样品组成与裂解产物；裂解机理和反应动力学研究(5)适合于各种形态样品粘稠液体、粉末、纤维及弹性体、固化树脂、涂料硫化橡胶、塑料等；(6)简单、易行,2.流程,3.对裂解器的要求,(1)裂解反应控制裂解温度的精确控制(裂解温度不同，裂解产物不同)；可重复进行；(2)裂解温度范围可调不同物质需要不同的裂解温度；400-1500C(3)裂解器与接口的体积小减小死体积；防止色谱峰变宽；(4)对裂解反应无催化反应防止歧化反应和二次反应；,4.裂解器,(1)管式炉裂解器外壁加热的圆管，简单，易于控制。死体积大，二次反应突出；(2)热丝裂解器样品放置在加热丝的螺旋管中；(3)居里点裂解器利用电磁感应加热；铁磁性材料置于高频电场中，吸收射频能量迅速升温，达到居里点温度时，变为顺磁质，不再吸收能量，温度稳定在该点；样品放置在铁磁性材料制成的加热元件上。不同组成的铁磁质合金具有不同居里点温度；(3)激光裂解器,第三节、顶空气相色谱的技术与应用,对液体或固体试样中的挥发性成分进行气相色谱分析的技术；试样置于密闭的恒温系统中，气-液（气-固）两相达到热力学平衡时，测定气相组成。,两种方式：静态法：恒温密闭系统，平衡时，测定气相组成；动态法：吹扫-捕集法，采用吸附剂吸附，加热解吸。,理论依据,当顶空瓶中样品上面的蒸气压相当低时，峰面积Ai的大小与样品上面的气相中挥发性组分i的蒸气压pi成正比Ai=fipifi为校正因子，在真实体系中，蒸气分压通常用下式表示：pi=poiixipoi为气相中组分i的摩尔分数；xi为样品中组分i的摩尔分数；i为组分i的活度系数。Ai=fipi=fiixipoi当系统平衡时：Ai=fipi=kixi通过顶空分析，可确定试样中的含量。,一、概述,质谱：纯物质结构分析色谱：化合物分离色谱-质谱联用：共同优点GC-MS；LC-MS；CZE-MS（毛细管电泳-质谱）困难点：载气(或流动液)的分离；出峰时间监测；仪器小型化；关键点：接口技术(分子分离器),第四节色谱质谱联用仪,GC-MS中的分子分离器,分子分离器类型：微孔玻璃式、半透膜式和喷射式三种。喷射式分子分离器：由一对同轴收缩型喷嘴构成，喷嘴被封在一真空室中，如图所示。可做成多级。,四极杆质量分析器￥,三、LC-MS联用仪器,1.大气压电离技术（API）（1）电喷雾电离（APIElectrospray）不适用于非极性化合物,（2）大气压化学电离,热喷雾(100-120C)，化学电离;适用于热稳定化合物分析,电喷雾电离,流出液在高电场下形成带电喷雾，在电场力作用下穿过气帘；气帘的作用：雾化；蒸发溶剂；阻止中性溶剂分子,2.离子阱质量分析器,特定m/z离子在阱内一定轨道上稳定旋转，改变端电极电压，不同m/z离子飞出阱到达检测器；-介电常数;-毛细管壁的Zeta电势。电渗流=0E/实际电泳分析，可在实验测定相应参数后，按下式计算电渗流=Lef/teoLef-毛细管有效长度;teo-电渗流标记物（中性物质）的迁移时间。,HPCE中电渗流的方向,电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质：内表面带负电荷,溶液带正电荷,电渗流流向阴极；内表面带正电荷,溶液带负电荷,电渗流流向阳极；石英毛细管；带负电荷，电渗流流向阴极；改变电渗流方向的方法：（1）毛细管改性表面键合阳离子基团；（2）加电渗流反转剂内充液中加入大量的阳离子表面活性剂,将使石英毛细管壁带正电荷,溶液表面带负电荷.电渗流流向阳极.,4.HPCE中电渗流的流形,电荷均匀分布，整体移动，电渗流的流动为平流，塞式流动（谱带展宽很小）；液相色谱中的溶液流动为层流，抛物线流型，管壁处流速为零，管中心处的速度为平均速度的2倍（引起谱带展宽较大）。,5.HPCE中电渗流的作用,电渗流的速度约等于一般离子电泳速度的57倍；各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为：+=电渗流+ef阳离子运动方向与电渗流一致；-=电渗流-ef阴离子运动方向与电渗流相反；0=电渗流中性粒子运动方向与电渗流一致；（1）可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离；（2）改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性，这是HPCE中优化分离的重要因素；（3）电渗流的微小变化影响结果的重现性；在HPCE中，控制电渗流非常重要。,三、HPCE中影响电渗流的因素,1.电场强度的影响电渗流速度和电场强度成正比，当毛细管长度一定时，电渗流速度正比于工作电压。,2.毛细管材料的影响不同材料毛细管的表面电荷特性不同，产生的电渗流大小不同；,电渗流=0E/,3.电解质溶液性质的影响,（1）溶液pH的影响对于石英毛细管，溶液pH增高时，表面电离多，电荷密度增加，管壁zeta电势增大，电渗流增大，pH=7，达到最大；pH电泳，负电胶束以较慢的速度向负极移动；,5)色谱与电泳分离模式的结合。,3)中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长；4)可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围；,1)根据等电点差别分离生物大分子的高分辨率电泳技术；2)毛细管内充有两性电解质（合成的具有不同等电点范围的脂肪族多胺基多羧酸混合物），当施加直流电压（68V）时，管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高的pH梯度；3)氨基酸、蛋白质、多肽等的所带电荷与溶液pH有关，在酸性溶液中带正电荷，反之带负电荷。在其等电点时，呈电中性，淌度为零；,4、毛细管等电聚焦,4)聚焦：具有不同等电点的生物试样在电场力的作用下迁移，分别到达满足其等电点pH的位置时，呈电中性，停止移动，形成窄溶质带而相互分离；,5)阳极端装稀磷酸溶液，阴极端装稀NaOH溶液；6)加压将毛细管内分离后的溶液推出经过检测器检测；7)电渗流在CIEF中不利，应消除或减小。,1.将两种淌度差别很大的缓冲液分别作为前导离子(充满毛细管)和尾随离子，试样离子的淌度全部位于两者之间，并以同一速度移动。2.负离子分析时，前导电解质的淌度大于试样中所有负离子的。所有试样都按前导离子的速度等速向阳极前进，逐渐形成各自独立的区带而分离。阴极进样，阳极检测。,5、毛细管等速电泳,3.不同离子的淌度不同，所形成区带的电场强度不同(=E)，淌度大的离子区带电场强度小；沿出口到进口，将不同区带依次排序1、2、3、4电场强度依次增大。假设“2”号中离子扩散到“3”号，该区电场强度大，离子被加速，返回到“2”区；当“2”号中离子跑到“1”号区，离子被减速使之归队；4.特点：界面明显，富集、浓缩作用；,在毛细管壁上键合或涂渍高效液相色谱的固定液，以电渗流为流动相，试样组分在两相间的分配为分离机理的电动色谱过程；,6、毛细管电渗色谱,九、高效毛细管电泳应用与进展1、离子分析,阳离子分析迁移方向和电渗流方向一致；4.5min内分离了24种金属离子；阳极进样，阴极检测；具有很高的灵敏度；,阴离子分析,阴离子电泳方向和电渗流方向相反、速度接近，分析时间长、效率低；质量小、电荷密度大的离子如：SO4-2、Cl-、F-等，电泳速率大于电渗流，阳极端流出，在阴极端无法检测；加入电渗流改性剂，十六烷基三甲基溴化胺等，使电泳方向和电渗流方向一致，可在3.1min内分离36种阴离子；阴极进样，阳极检测；,2、药物分析,检测体液或细胞中某些代谢产物的分析；尿液中的氨基酸含量作为临床诊断糖尿病的辅助手段；采用毛细管区带电泳方式，在11min内分离17种药物；,采用MEKC模式，鉴定违禁药物；效果优于HPLG法,3、手性化合物分析,合成获得单一手性化合物相当困难；528种手性合成药物，61种以单一对映体形式销售，其他为外消旋体；检测分析也相当困难；研究热点；R-反应停是安眠药，S-式致胎儿畸形；HPCE分离分析手性化合物的方法：加入手性选择剂；形成配合物的稳定常数有差异，结合HPCE的高效率；常用手性选择剂：环糊精及其衍生物；手性冠醚；手性表面活性剂（氨基酸衍生物、胆酸钠、牛磺脱氧胆