McAb单克隆抗体

单克隆抗体（monoclonalantibody,McAb),概述,1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术，这项技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度准确的新纪元。,免疫细胞化学的技术关键之一是制备特异性强，亲和力大，滴度高的特异性抗体。由于每种抗原都有几个抗原决定簇，用它免疫动物将产生对各个决定簇的抗体，即多克隆抗体，单克隆抗体则是由一个产生抗体的细胞与一个骨髓瘤细胞融合而形成的杂交瘤细胞经无性繁殖而来的细胞群产生的，所以它的免疫球蛋白属同一类型，质地纯一，而且它是针对某一抗原决定簇的，因此特异性强，亲和性也一致。,McAb和常规免疫血清抗体的比较,单克隆抗体的制备,（一）动物的选择与免疫1.动物的选择：纯种BALB/C小鼠（常用）2.免疫动物：可溶性抗原或颗粒性抗原（二）细胞融合1.骨髓瘤细胞系的选择：骨髓瘤细胞应和免疫动物属于同一品系，这样杂交率高2.饲养细胞：在组织培养中，单个或少数分散的细胞不易生长繁殖，若加入其他活细胞则可促进这些细胞生长繁殖，所加入的细胞称饲养细胞。常用的有小鼠腹腔巨噬细胞、小鼠脾脏细胞或胸腺细胞。,细胞融合步骤（1）制备饲养层细胞：取同品系小鼠，610周龄处死浸泡在75酒精35min用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜用无菌注射器注入5ml预冷的培养液（严禁刺破肠管）反复冲洗，吸出冲洗液冲洗液放入10ml离心管，1200rpm离心56min用含20NCS或FCS的培养液悬浮，调整细胞数至1105加入96孔板，100ul每孔放入37CO2培养箱培养,制备免疫脾细胞：最后一次加强免疫3天后处死小鼠无菌取脾脏，培养液清洗脾脏研碎，过不锈钢筛网离心，细胞用培养液洗2次取108脾脏细胞备用制备骨髓瘤细胞：取对数生长骨髓瘤细胞离心用无血清培养液洗2次取107细胞备用,融合：,将骨髓瘤细胞与脾脏细胞按1：10或1：5的比例混合，在50ml离心管中用无血清培养液洗1次，离心1200rpm,8min，弃上清；90s内加入37预温的1ml45PEG溶液，边加边摇，37水浴90s；加37预温的不完全培养液以终止PEG作用，每隔2min分别加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml；,聚乙二醇（PEG）可沉淀蛋白质,离心，800rpm,6min；弃上清，用含20小牛血清HAT选择培养液重悬；将上述细胞加入已有饲养细胞的96孔培养板内，每孔100ul，放入375CO2培养箱培养,（三）选择杂交瘤细胞及抗体的检测,HAT培养液：次黄嘌呤（H)、氨基蝶呤（A）、胸腺嘧啶（T)，氨基蝶呤可阻断DNA的合成。胸腺嘧啶激酶（TK）、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）。如细胞含有此两种酶则可启动补救途径。在HAT培养液中，骨髓瘤细胞缺乏TK或HGPRT而不能生长，而脾细胞能生长但不能长期增殖而死亡，只有杂交瘤细胞具有以上两种酶故能生长。抗体的检测：RIA、ELISA等。,（四）杂交瘤的克隆化,杂交瘤的克隆化指将抗体阳性孔进行克隆化。原则：尽早作用:分开抗体分泌细胞和非分泌细胞及其他抗体分泌细胞，非分泌细胞比分泌细胞生长快，可抑制分泌细胞的生长。方法：常用的是有限稀释法和软琼脂平板法。,（五）杂交瘤细胞的冻存和复苏（六）单克隆抗体的大量生产：体外培养法和体内接种杂交瘤细胞，收取腹水或血清。（七）单克隆抗体的鉴定：特异性鉴定；类与亚类的鉴定；中和活性的鉴定；识别抗原表位的鉴定；亲和力的鉴定。,单克隆抗体的应用,医学检验试剂：主要用于特异性、敏感性要求高的的实验技术中传染病的快速诊断；寻找肿瘤特异性抗原及检测肿瘤相关抗原；免疫细胞抗原检测，如CD抗原；HLA分型抗原检测；血中药物浓度监测。导向治疗：生物导弹或免疫导弹抗原物质的分离和提纯：如IFN的提取,Y-C花环实验,YC3b复合物的制备（Yeast:酵母菌）：称取干酵母粉10mg，加入1640培养基1ml，再加入豚鼠血清（豚鼠血清中补体含量最多）1ml。置37水浴箱30分钟，其间振荡三次。30分钟后取出离心（1500转/分，5分钟），然后用1640培养基洗涤两次（1500转/分，5分钟）。最后加入1640培养基1ml（终浓度为1%），吹吸均匀，置4冰箱备用。,原理,酵母菌可通过旁路途径激活补体，产生C3b，酵母菌与C3b结合形成了Y-C3b复合物。若将此复合物与巨噬细胞共育，因巨噬细胞表面有C3b受体，则此复合物可结合到巨噬细胞表面形成Y-C花环。,操作方法,取小白鼠一只，于腹腔内注射1640培养基10ml，510分钟内处死小白鼠抽取腹腔液。吸0.5ml腹腔液滴于洁净玻片上，然后置于湿盒内，放置37水浴箱半小时。半小时后取出，用清水冲去玻片上多余的腹腔液（巨噬细胞黏附于玻片上），然后加0.5mlY-C复合物，置于4冰箱20分钟（这个温