第10章_酶作用机制和酶调节

,网络教程,酶的作用机制和酶的调节,章节目录,一、酶的活性部位,二、酶催化反应的独特性质,三、影响酶催化效率的有关因素,四、酶催化反应机制的实例,五、酶活性的调节控制,六、同工酶,一、酶的活性部位,（一）酶活性部位的特点,胰凝乳蛋白酶与底物的结合,活性部位在酶分子的总体积中只占相当小的部分酶的活性部位是一个三维实体酶的活性部位并不是和底物的形状正好互补的，它们是通过诱导契合的过程使两者互补酶的活性部位是位于酶分子表面的一个裂缝内底物通过次级键较弱的力结合到酶上酶活性部位具有柔性或可运动性,酶活性部位的特点,胰凝乳蛋白酶的结构,酶氨基酸残基数活性部位的氨基酸残基核糖核酸镁A124His12，His119，Lys41溶菌镁129Asp52，Glu35胰凝乳蛋白酶241Asp57，Asp102，Ser195胰蛋白酶223Asp57，Asp102，Ser195弹性蛋白酶240Asp57，Asp102，Ser195胃蛋白酶348Asp32，Asp215HIV-1蛋白酶992Asp25木瓜蛋白酶212Cys25，His159枯草杆菌蛋白酶275His64，Ser221，Asp32碳酸酐酶259His94-Zn-Lys96His119羧肽酶A307Arg127，Glu270，Tyr248，Zn2+旰乙醇脱氢酶3742Ser48，His51，NAD+，Zn2+,某些酶活性部位的氨基酸残基,1酶分子侧链基团的化学修饰法,（1）非特异性共价修饰,（2）特异性共价修饰,（3）亲和标记法,2动力学参数测定法,3X射线晶体结构分析法,4定点诱变法,研究酶活性部位的方法(1),酶分子侧链基团的化学修饰法,用带标记的化合物与酶的活性部位氨基酸残基侧链基团共价结合，然后水解该酶，分离出带有标签的肽段，即可分析出活性部位的氨基酸残基。,化学试剂已和活性部位基团结合的鉴定标准：其一：酶活力的丧失程度和修饰剂浓度成一定的比例关系其二：底物或活性部位结合的可逆抑制剂可保护共价修饰剂的抑制作用,如果某些基团修饰后不引起酶活力的变化，可以初步认为，此基团可能是非必需基团。如果某些基团修饰后引起酶活力的变化，则此基团可能是酶的必需基团。,特异性共价修饰,研究酶活性部位的方法(2),定点诱变法,根据蛋白质结构研究的结果，可以利用定点诱变技术，改变编码蛋白质基团中的DNA顺序，研究酶活力部位的必需氨基酸如果被代换的氨基酸不影响酶的活性，则该位置的氨基酸残基不是必需基团如果被代换的氨基酸使酶活性丧失或降低，则该位置的原有氨基酸残基是必需基团Vmax不变，Km值升高，该位置氨基酸为结合基团Vmax降低，Km值不变，该位置氨基酸为催化基团酶活性完全丧失，该位置氨基酸为必需基团,研究酶活性部位的方法(3),（1）酶反应可以分为两类，一类反应仅仅涉及到电子的转移，另一类反应涉及到电子和质子两者或其他基团的转移,（2）酶的催化作用是由氨基酸侧链上的功能基团和辅酶为媒介的,（3）酶催化反应的最适pH范围通常狭小,（4）与底物相比较，酶分子很大，而活性部位通常只比底物稍大一些,（5）酶除了具有进行催化反应所必需的活性基团外，还有别的特性,在活性部位存在1个以上的催化基团，所以能进行协同催化存在结合部位，因此底物分子可以以反应中固有的方位结合在活性部位附近在包含有2个或2个以上底物分子参加反应的情况中，存在着一个以上的底物分子结合的部位底物以某种方式结合到酶分子上，使底物分子中的键产生张力，从而有利于过渡态复合物的形成,二、酶催化反应的独特性质,邻近效应,酶与底物结合形成中间复合物以后，使底物和底物之间，酶的催化基团与底物之间结合与同一分子而使有效浓度得以极大的升高，从而使反应速率大大增加。,三、影响酶催化效率的有关因素,反应物的反应基团之间和酶的催化基团与底物的反应基团之间的正确取位产生的效应,由于活性中心的立体结构和相关基团的诱导和定向作用，使底物分子与反应的基团相互接近，并被严格定向定位，使酶促反应具有高效率和专一性特点。,定向反应(1),二羧酸单苯酯水解相对速率和结构关系,定向反应(2),酶与底物相互接近时，其结构相互诱导、相互形变进而相互结合酶的构象改变有利于与底物结合；底物在酶诱导下发生形变，处于不稳定状态（过渡态），易受催化基团的攻击过渡态的底物与酶的活性中心结构最吻合,诱导契合,酸碱催化是通过瞬时的向反应物提供质子或从反应物接受质子以稳定过渡态，加速反应的一类催化机制。,专一的酸碱催化（狭义的酸碱催化）：在水溶液中通过高反应性的质子和氢氧离子进行的催化反应,总酸碱催化（广义的酸碱催化）：通过H+和OH-以及能提供H+及OH-的供体进行的催化反应,缓冲液浓度,kobs,kobs,pH8,pH6,pH7,pH8,pH7,pH6,酸碱催化（1）,酶分子中可作为总酸碱催化的功能基团,酸碱催化（2）,胰凝乳蛋白酶通过酸碱催化使肽键断裂,水解,酸碱催化（3）,在催化时，亲核催化剂或亲电子催化剂能分别放出电子或汲取电子并作用于底物的缺电子中心或负电子中心，迅速形成不稳定的共价中间复合物，降低反应活化能，使反应加速,-,磷酰酶,葡萄酶,共价催化,需要金属的酶可以分为：金属酶和金属-激活酶两类,金属离子以3种主要途径参加催化过程（1）通过结合底物为反应定向（2）通过可逆地改变金属离子的氧化态调节氧化还原反应（3）通过静电稳定或屏蔽负电荷,金属离子催化（1）,金属离子催化（2）,金属离子催化（2）,在酶催化反应中，常常是几个基元催化反应配合在一起共同起作用。例如胰凝乳蛋白酶是通过Asp102、His57、Ser195组成的“电荷中继网”催化肽键水解，包括亲核催化和碱催化共同作用。这种多元催化协同作用的结果是使酶加速的一个因素。,多元催化和协同效应,酶分子表面有一个裂缝，活性部位就位于疏水环境的裂缝中。在非极性环境中的介电常数较在水介质的介电常数低。在非极性环境中两个带电基团之间的静电作用比在极性环境中显著增高,活性部位微环境的影响,胰凝乳蛋白酶,四、酶催化反应机制的实例,溶菌酶(2),溶菌酶催化作用,溶菌酶(3),溶菌酶催化作用,溶菌酶(4),胰核糖核酸酶A（1）,胰核糖核酸酶A（2）,A.酶切法用枯草杆菌蛋白酶限制性水解20-21氨基酸残基间肽键，得到S肽（20肽）和S蛋白（104肽），两者均无活性S肽与S蛋白在中性pH共同保温，可恢复活性人工合成S肽氨基端的13个氨基酸与S蛋白共同保温，可恢复70%活性去除人工肽His12和Met13的S肽，共同保温不能恢复活性,B.化学修饰法碘乙酸修饰His119和His12，酶失活酶与胞嘧啶核苷3-磷酸抑制剂结合，碘乙酸不能在修饰2，4-二硝基氟苯修饰Lys41，酶失活,C.结论：活性中心由His119、His12、Lys41构成,胰核糖核酸酶A（3）,羧肽酶A(1),羧肽酶A(2),羧肽酶A(3),丝氨酸蛋白酶是一类最有特色的酶家族，这个家族包括：,胰蛋白酶、,胰凝乳蛋白酶、,弹性蛋白酶、,凝血酶、,枯草杆菌蛋白酶、,纤溶酶、,组织纤溶酶原激活剂,消化酶，在胰腺中合成，在消化道中通过除去部分肽链转变成活性酶形式,在血凝级联中是一个重要的酶,一种细菌蛋白酶,裂解血凝块的纤维多聚体,特异地裂解纤溶酶原产生纤溶酶,乙酰胆碱酯酶,丝氨酸酯酶，能降解神经递质乙酰胆碱,丝氨酸蛋白酶(1),丝氨酸蛋白酶(2),丝氨酸蛋白酶通过共价催化和广义酸碱催化的混合方式进行,丝氨酸蛋白酶(3),酶活性部位位于酶分子表面凹陷的小口袋中,丝氨酸蛋白酶(4),用于研究胰凝乳蛋白酶机制的人工底物,丝氨酸蛋白酶(5),胰凝乳蛋白酶两阶段反应机制,稳态阶段,突发阶段,p硝基苯酚,乙酸,丝氨酸蛋白酶(6),胰凝乳蛋白酶,酶-底物复合物,疏水口袋,催化三联体,活性部位,底物（一种多肽）,胰凝乳蛋白酶反应的详细机制,丝氨酸蛋白酶(7),Ser195-OH的O与肽键的羰基C共价结合，H结合于His57的N上,胰凝乳蛋白酶反应的详细机制,丝氨酸蛋白酶(8),His提供H给肽键的N形成-NH2，肽键断裂，释放第一个产物,胰凝乳蛋白酶反应的详细机制,丝氨酸蛋白酶(9),加水，His-N攻击H2O的H，OH-的O攻击羰基C,胰凝乳蛋白酶反应的详细机制,丝氨酸蛋白酶(10),His-N攻击H2O的H，H2O裂解，OH-的O攻击羰基C,胰凝乳蛋白酶反应的详细机制,丝氨酸蛋白酶(11),His-NH提供H给Ser的O，第二个产物形成，但仍与酶结合,胰凝乳蛋白酶反应的详细机制,丝氨酸蛋白酶(12),第二个产物释放，酶再生,胰凝乳蛋白酶反应的详细机制,丝氨酸蛋白酶(13),名称来源功能,天冬氨酸酶的某些代表,胃蛋白酶动物胃消化饮食蛋白,凝乳酶动物胃消化饮食蛋白,组织蛋白酶脾、肝和许多其他动物组织溶酶体蛋白消化,肾素肾转换血管紧张肽原成为血管紧张肽调节血压,HIV-1蛋白酶AIDS病毒加工AIDS病毒蛋白,天冬氨酸蛋白酶(1),天冬氨酸蛋白酶(2),天冬氨酸蛋白酶的机制,天冬氨酸蛋白酶(3),天冬氨酸蛋白酶(4),天冬氨酸蛋白酶(5),（一）别构调控,酶分子的非催化部位与某些化合物可逆地非共价结合后发生构象的改变，进而改变酶活性状态，称为酶的别构调节具有这种别构调节作用的酶称为别构酶凡是能使酶分子发生别构作用的物质称为效应物（别构剂）因别构导致酶活性增加的物质称正效应物（别构激活剂）因别构导致酶活性降低的物质称负效应物（别构抑制剂）代谢底物经常是别构酶的别构激活剂，代谢产物往往是别构抑制剂别构酶通常是寡聚酶,五、酶活性的调节控制,别构调控(2),L-苏氨酸,L-异亮氨酸,苏氨酸脱水酶,异亮氨酸的合成,别构调控(3),别构激活模型,别构调控(4),A,B,ATCase中亚基的排列,A.ATCase三重对称轴的俯视,B.ATCase的垂直观,别构调控(5),别构调控(6),正、负协同别构酶与非别构酶的动力学曲线比较,1、非别构酶2、正协同3、负协同,别构调控(7),A为K型效应物，B为V型效应物,1、未加效应物2、加激活剂3、加抑制剂,别构调控(8),别构模型,别构酶的齐变模型,别构酶的序变模型,别构调控(9),合成部位酶原有活性的酶,胰脏弹性蛋白酶原弹性蛋白酶,酶原某些活性酶的无活性前体蛋白（如果不是酶，则称某蛋白原），这种前体蛋白经过蛋白水解酶专一作用后，构象发生变化，形成酶的活性部位，变成活性蛋白酶原激活的本质活性中心的形成或暴露过程,胃胃蛋白酶原胃蛋白酶,胰脏胰凝乳蛋白酶原胰凝乳蛋白酶,胰脏胰蛋白酶原胰蛋白酶,胰脏羧肽酶原羧肽酶,胃和胰脏的酶原和有活性的酶,酶原激活(1),酶原激活(2),酶原激活(3),酶原激活(4),胰凝乳蛋白酶原与胰蛋白酶原的激活过程,酶原激活(5),血液凝固的级联放大作用,酶原激活(6),这种调控作用是通过共价调节酶作用，通过其他酶对其多肽链上某些基团进行可逆的共价修饰，使其处于活性与非活性的互变状态，从而调节酶活性。,特点在修饰过程中，酶的活性在无活性（或低活性）与有活性（或高活性）两种状态中改变共价修饰的互变是由不同的酶催化的属于酶活性的快速调节,常见的共价修饰形式磷酸化与脱磷酸化甲基化与脱甲基化腺苷化与脱腺苷化-SH与-S-S-互变,可逆的共价修饰(1),酶修饰反应的例子,可逆的共价修饰(2),磷酸化,腺苷酰化,尿苷酰化,ADP-核糖基化,甲基化,磷酸化酶b（无活性）,磷酸化酶磷酸酶,磷酸化酶激酶,磷酸化酶a（有活性）,可逆的共价修饰(3),同工酶是指催化相同的化学反应，但其蛋白质分子结构、物理性质和免疫性能等方面不一样的一组酶同工酶都是寡聚酶同工酶存在于同一种属或同一个体的不同组织或同一细胞的不同亚细胞结构中同工酶是长期进化的产物同工酶对进化、发育与细胞分化等的研究有重要意义同工酶可用于疾病的诊断,六、同工酶,LDH同工酶，由两种不同亚基组成的四聚体，有5种同工酶，在不同的组织中含量不同分别是：LDH1LDH2LDH3LDH4