科学·技术·社会　DNA指纹技术 (2)

DNA指纹技术,Contents,DNA指纹的含义,DNA指纹：待测样品DNA经限制酶酶切、电泳、转膜，以重复序列中的核心序列为探针进行DNA印迹杂交所形成的具有特征性的杂交图谱。由于DNA指纹具有完全个体特异的多态性，其个体识别能力足以与手指指纹相媲美，因而得名。,DNA指纹的含义,人类和动植物基因组中含有可变数目重复序列（VNTR序列），且广泛地分布于整个基因组中。由于这种串联重复序列的增加或丢失所造成的变异通常不会被选择，因此这些变异的积累就导致一个物种内非亲缘关系个体间基因组中存在的巨大差异。而且，由于不同个体的重复数目具有很大差异，造成了人类群体中丰富的多态性。,DNA指纹的含义,DNA指纹技术：利用不同的串联重复序列的易变性和高度个体特征的潜在性，通过特定的重复序列的DNA探针，使来自基因组不同区域的许多序列片段同时被检测，使重复序列的高度多样性同时产生多位点基因带谱。DNA指纹技术是分子生物学各种新兴技术中的一种,目前已被广泛应用于法医学、疾病诊断、肿瘤研究等领域。,DNA指纹的特点,1.多位点性高分辨率的DNA指纹图谱通常由15-30条带组成，看上去就像挂号信上的条码签一样。DNA指纹区中的绝大多数区带是独立遗传的，因此一个DNA指纹探针能同时检测基因组中数十个位点的变异性。,2.简单的遗传方式DNA是人的遗传物质，其特征是由父母遗传的。分析发现，DNA指纹图谱中几乎每一条带纹都能在其双亲之一的图谱中找到，这种带纹符合经典的孟德尔遗传规律，即双方的特征平均传递50给子代。,DNA指纹的特点,3.高度变异性不同的个体或群体有不同的DNA指纹图。一般选用任何一种识别四个碱基的内切酶来切DNA，经过电泳后，这种个体间差异性就能表现出来。英国遗传学家杰弗里斯对白种人研究表明，两个随机个体具有完全相同的DNA指纹图的概率为3000亿分之一，两个同胞个体具有相同图谱的概率也仅仅为200万分之一。,DNA指纹的特点,DNA指纹图谱法操作,提取DNA,PCR技术扩增,高可变位点,酶切,DNA片断,琼脂糖凝胶电泳,DNA片段杂交,放射自显影,DNA指纹图谱,1.提取样品中的DNA；2.若提取DNA量很少，可将其进行PCR扩增，得到大量DNA。3.选用与探针配对的限制性核酸内切酶，在长链DNA位置上加以切割，将分子量很大的DNA长链切成许多长度不同的小片段。4.在胶板尺寸较长的凝胶电泳仪中，对酶解完全后的DNA片段进行电泳，各酶切片段就会按其长度大小在电场中进行分离。5.先用碱性溶液使凝胶板中分离开的双链DNA片段变性为单链片段，然后将凝胶板夹在尼龙膜中，并永久性地固定在尼龙膜上。6.让放射性DNA探针与尼龙膜上的单链DNA片段进行杂交。7.用放射性胶片与尼龙薄膜叠放，尼龙膜上的放射性探针便会发出X射线使胶片曝光，从而使杂交探针的长度不同的DNA片段位置显影在胶片上，便是所谓的DNA指纹。,第一个DNA指纹,早在1984年，英国莱斯特大学的遗传学家Jefferys及其合作者首次通过DNA分子生物学实验方法获得了一系列可以在胶片上看到的图纹，这些图纹极少有两个人完全相同，故称为“DNA指纹”，意思是它与人的指纹一样是每个人所特有的。产生DNA指纹图谱的过程就叫做DNA指纹分析。,遗传学家Jefferys和第一张DNA指纹,第一个DNA指纹,探针：肌红蛋白基因第一个内含子中的串联重复序列DNA片段：8个含有串联重复序列（小卫星）的重组克隆每个克隆都含有一个长0.22.0kb、由重复单位重复329次组成的小卫星DNA。这8个小卫星都含有一段相同的核心序列，其碱基顺序为GGGCAGGAA。他们用16bp重复单位（主要为核心序列）重复29次而成的小卫星33.15做探针，与人基因组酶切片段进行Southern杂交，产生由10多条带组成的杂交图谱，不同个体杂交图谱上带的位置是千差万别的。随后他们用另外一个小卫星探针33.6进行测试，获得了类似的图谱。,第一个DNA指纹,限制性片段长度多态性标记(RestrictionFragmentLengthPolymorphism，RFLP)：是一种以DNA-DNA杂交为基础的第一代遗传标记，国外在20世纪70年代发展起来的DNA片段分析技术。在许多领域都有成功的应用，也常用于构建各种DNA指纹图谱。,构建指纹图谱的技术,限制性内切酶,识别、切割,DNA片段,凝胶电泳,Southern杂交放射自显影,RFLP图谱,RFLP图谱所代表的是基因组DNA在限制性内切酶消化后产生片段在长度上差异。由于不同个体的等位基因之间碱基的替换、重排、缺失等变化导致限制内切酶识别和酶切发生改变从而造成基因型间限制性片段长度的差异。,RFLP优点：无表型效应，其检测不受环境条件和发育阶段影响；共显性，可以区别纯合基因型和杂合基因型；可利用的探针很多，可以检测到很多遗传位点。RFLP缺点：对DNA质量要求高，需要量大，操作复杂，通常要接触放射性。,构建指纹图谱的技术,数目可变串联重复多态性(VNTR）VNTR基本原理与RFLP大致相同，只是对限制性内切酶和DNA探针有特殊要求：限制性内切酶的酶切位点必须不在重复序列中，以保证小卫星或微卫星序列的完整性。内切酶在基因组的其他部位有较多酶切位点，则可使卫星序列所在片段含有较少无关序列，通过电泳可充分显示不同长度重复序列片段的多态性。分子杂交所用DNA探针核酸序列必须是小卫星序列或微卫星序列，通过分子杂交和放射自显影后，就可一次性检测到众多小卫星或微卫星位点，得到个体特异性的DNA指纹图谱。,构建指纹图谱的技术,VNTR优点：小卫星标记的多态信息含量较高。VNTR缺点：数量有限，而且在基因组上分布不均匀，这就极大限制其在基因定位中的应用。VNTR也存在实验操作繁琐、检测时间长、成本高的缺点。,构建指纹图谱的技术,随机扩增多态性DNA技术(RandomAmplifiedPolymorphicDNA，RAPD)随机扩增片段长度多态性DNA，是由Williams和Welsh（1990）同时发展起来的一项新的遗传标记技术。RAPD以PCR为基础而又不同于经典的PCR，一般采用10个核苷酸的DNA序列为引物，扩增时退火温度降至35左右。对于不同模板DNA，用同一引物扩增既可能得到相同的带谱（模板基因组间可能具有同源性），也可能得到不同的带谱。仅在某一特定模板中出现的条带就可作为该模板的分子标记。在一定的扩增条件下，扩增的条带数取决于基因组的复杂性。对特定的引物，复杂性越高的基因组所产生的扩增条带数也越多。,构建指纹图谱的技术,RAPD优点：技术简单，检测速度快；成本较低；不依赖于种属的特异性和基因组的结构，合成的一套引物可用于不同生物基因组的分析；操作简单，可实现自动化，短期内可利用大量引物完成覆盖基因组的分析；不需制备探针、杂交等程序，成本较低；DNA用量少（10ngDNA即可完成一次分析），允许快速、简单地分离基因组DNA。,构建指纹图谱的技术,构建指纹图谱的技术,RAPD缺点：RAPD标记是一个显性标记，不能鉴别杂合子和纯合子；存在共迁移问题，凝胶电泳只能分开不同长度DNA片段，而不能分开那些分子量相同但碱基序列组成不同的DNA片段；RAPD技术中影响因素很多，所以实验的稳定性和重复性差。目前广泛用于中药DNA指纹图谱的构建、生物的品种鉴定、系谱分析及进化关系的研究上。RAPD技术具有广阔的应用前景。,DNA指纹的应用,法医学鉴定中有重要意义物种进化及起源的应用品种、品系和类群的鉴定动物遗传监测中的应用在蚕业上的应用基因定位和构建基因图谱杂交优势预测在流行病学方面的运用疾病诊断及治疗及肿瘤的研究等,DNA指纹的应用,举例：亲子鉴定分别将父亲和孩子的DNA为模板用一对引物进行P