基因操作原理

基因操作原理题库名词解释1.同裂酶isoschizomer：识别相同序列的不同的限制性内切酶。2.星性活性star activity：在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星性活性。3.质粒不相容性：2个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒不相容性，它是指在第二个质粒导入后，在不涉及DNA限制系统时出现的现象。4.饱和诱变saturation mutagenesis：对基因的某一小区域内碱基进行多种形式的置换（在关键位置引入不同的氨基酸探寻何种替换可以获得最大活性）5.定点诱变：利用人工合成的寡聚苷酸，在离体的条件下，制造基因中任何部位的位点特异性突变的技术。6.突变抑制基因：某一突变基因的表型效应由于第二个突变基因的出现而恢复正常时，称后一基因为前者的抑制基因。7.融合表达载体：表达载体的多克隆位点上有一段融合表达标签（Tag）,表达产物为融合蛋白（有分N 端或者C端表达），方便后继的纯化步骤或检测。8.克隆载体：为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。9.穿梭载体shuttle vector：含有不同宿主的不同的复制起始点，能在不同的宿主中进行复制增殖，一种克隆载体, 可在2种或多种宿主中克隆,常用于重组DNA在E.coli中克隆再转到另一种生物(eg.yeast)中表达。10.置换载体(replacement vectors)：少数载体分子如噬菌体基因组的中间片段与噬菌体的感染能力和DNA复制功能无关，因此这个片段可以用限制酶加以切除，代之以外源DNA片段。11亲和层析（affinity chromatography）利用共价连接有特异配体的层析介质，分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白或其它分子的层析技术。12基因文库(Gene library)：即某种生物类型全部gene的以重组体形式存在的集合。将某种生物的总DNA酶切，然后连接载体，再转移到适当的宿主细胞中，通过细胞的增殖而构成各个片段的无性繁殖系(克隆)，当这些克隆多到可以包括某种生物的全部基因时，这一批克隆的总体就称为该种生物的基因文库。13亚基因组文库（subgenomic library）用基因组DNA的特定部分所构建的基因文库，可用质粒DNA，线粒体DNA，限制性DNA片段来构建。可通过Southern杂交，用探针找出目标gene所在的限制性片段的大小，然后用相应大小的限制性DNA片段构建出gene文库。14双向电泳（two-dimensional electrophoresis）是等电聚焦电泳和SDS-PAGE的组合，即先进行等电聚焦电泳（按照等电点分离），然后再进行SDS-PAGE（按照分子大小分离），经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。酵母双杂交（Yeast two-hybrid system）是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。反式转录激活因子，往往由两个或两个以上结构上可以分开，功能上相互独立的结构域构成，其中有DNA结合功能域(BD)和转录激活结构域（AD）。这两个结合域将它们分开时仍分别具有功能，但不能激活转录，只有当被分开的两者通过适当的途径在空间上较为接近时，才能重新呈现完整的转录因子活性，使启动子下游基因得到转录。根据这个特性，将编码BD的基因与已知蛋白质的基因构建在同一个表达载体BD-protein上，将编码AD的基因和蛋白质文库的基因构建在AD-表达载体上。同时将上述两种载体转化改造后的酵母，表达两者的融合蛋白。当上述两种载体所表达的融合蛋白能够相互作用时，功能重建的反式作用因子能够激活酵母基因组中的报告基因，从而通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落，研究活细胞内蛋白质相互作用。信号标签诱变技术(Signature-Tagged Mutagenesis ,STM)是一种在突变基础上鉴定病原微生物毒力基因的阴性选择方法。其基本原理是在病原体致病过程相关的毒力基因中插入特异性标签的转座子,产生的突变体由于毒力基因的插入失活而无法引起病原菌持续性感染,结果导致病原体不能在宿主体内存活下来。通过突变体库感染宿主,然后对存活下来的突变体进行负筛选就可鉴定出病原体的毒力相关基因。该方法可以证明微生物在感染过程中可能涉及到的基因,及其基因对微生物在体内的增殖具有重要意义。反向PCR反向PCR(reverse PCR)是用反向的互补引物来扩增两引物以外的未知序列的片段。实验时选择已知序列内部没有切点的限制性内切酶对该段DNA进行酶切，然后用连接酶使带有粘性末端的靶序列环化连接，再用一对反向的引物进行PCR，其扩增产物将含有两引物外未知序列，从而对未知序进行分析研究。SH技术（subtractive hybridization）mRNA减法杂交（subtractive hybridization）技术又叫做差减cDNA克隆。它是通过构建差减文库(subtractive library)得以实现的。定义： 减法杂交是用过量的参照细胞的mRNA或cDNA与目的细胞的cDNA或mRNA(又称目的序列)杂交，形成的RNA-cDNA杂交体是两种细胞共有的，将其扣除。剩下的cDNA或mRNA可以标记成探针(称减法或扣除探针)，从前述的目的细胞的cDNA文库中筛选目的克隆；还可以用来构建文库，即减法文库。减法文库实质上是除去了一大批高丰度非特异性的cDNA。文库中含有的是特异表达的cDNA克隆及其他一些低丰度的mRNA的cDNA克隆。原理： 减法杂交的本质是除去那些普遍共同存在的cDNA序列，从而使欲分离的目的基因的序列得到有效的富集，提高了分离的敏感性。减法杂交工作原理：从表达目的基因的组织（以下简称+）提取mRNA所转录为cDNA，然后与无目的基因表达的组织（简称-）提取的mRNA做过量杂交，在+、-组织中均表达的基因产物形成cDNA/mRNA双链杂交分子，而特异mRNA反转录的cDNA仍保持单链状态，将这种单链cDNA分离出来即为差异表达的序列。抑制差减杂交( suppression subtractivehybridization , SSH)抑制差减杂交( suppression subtractivehybridization , SSH) 是基于抑制PCR 和差减杂交技术建立的简单有效的方法,通过一次差减杂交可使低丰度的序列(mRNA) 得以高于1000 倍的富集,有效的选择性扩增目标序列,同时抑制非目标序列的扩增,因此在分离基因特别是分离低丰度差异表达基因方面具有更广阔的应用前景。SSH 技术主要原理是以抑制PCR 为基础的cDNA 消减杂交。所谓抑制PCR 是利用非目标序列片段两端的长反向重复序列在退火时产生类似发卡的互补结构,无法作为模板与引物配对,选择性地抑制了非目的基因片段的扩增。在经过消减杂交后,根据复性动力学原理,浓度高的单链cDNA 分子迅速复性,浓度低的单链cDNA 分子仍以单链形式存在,使得杂交后不仅目的基因间的丰度差异基本消除,而且富集了差异表达基因。19. Pyrosequencing技术焦磷酸测序(Pyrosequencing)技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团（PPi）。PPi可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成。该技术是新一代DNA序列分析技术，无须进行电泳，DNA片段也无须荧光标记，操作极为简便。20. 易错 PCR（error prone PCR）易错 PCR（error prone PCR）是指在扩增目的基因的同时引入碱基错配，导致目的基因随机突变。然而，经一次突变的基因很难获得满意的结果，由此发展出连续易错PCR (sequential error prone PCR)策略。即将一次PCR扩增得到的有用突变基因作为下一次PCR扩增的模板，连续反复地进行随机诱变,使每一次获得的小突变积累而产生重要的有益突变。21. DNA shuffing 又称为DNA洗牌技术，先通过DNaseI对目的基因切割成随机片段，然后进行PCR重聚，由于同源重组而产生基因突变的方法，点突变率可以达到0.7 基因组shuffling：基因组改组(GenomeShuffling)技术在细胞群体层次上进行反复重组、选择，是定向进化领域的最新进展。与DNA shuffling类似，操作对象为单染色体组成的基因组。合成shuffling：人工合成的很多同源性很高的片段，人为的改变某些碱基，有意识，有目的的改变某些位点，得到多样性的突变库的一种技术。22. 功能互补筛选:一组含有大肠杆菌基因组全部基因序列结构的重组体DNA分子的异源群体,导入一种大肠杆菌营养缺陷型的受体细胞,然后将受体细胞涂布在一种缺少该菌株所需的底物的培养基上 ,因此只有那些获得了营养缺陷型互补基因的受体细胞才会生长成转化子菌落. 23. 分子进化工程：由DNA序列在试管中重排而最终导致蛋白质或RNA的体外定向进化，完成这一体外进化的过程称为分子进化工程。27. 随机诱变：突变发生的位置在很大程度上难以控制，突变后基因的功能难以预测，但产生的突变类型非常丰富。28. 体内诱变:利用温度敏感型大肠杆菌,28正常生长,37不能生长,因为DNA聚合酶失活.RNAi：是指双链RNA(doublestrandRNA,dsRNA)导入细胞后,使mRNA由于序列互补出现特异性降解,从而阻断该基因表达的现象。SGE：淀粉凝胶电泳RNaseH：一种降解RNA2DNA 杂交链中RNA 的酶,产生5-磷酸和3-OH 端。RNase H酶切产物因缺少5-cap 和3-poly A 尾而被细胞中的5和3外切酶降解。Knockout：基因敲除，是指对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平上设计实验，将该基因去除，或用其它顺序相近基因取代，可中止某一基因的表达。1.基因克隆的宏观策略1) 已知序列同源性的基因的克隆(PCR方法克隆目标基因) 根据已知基因序列信息设计引物，以基因组DNA为模板，扩增出目标基因。2) 定位在质粒上的基因克隆(杂交方法)利用识别六碱基的限制性内切酶(根据A 来源选择)酶解质粒DNA，电泳分离，然后用特异性探针进行杂交，确定基因片断进行克隆。3) 定位在染色体组上的基因克隆杂交方法.用识别四个碱基的限制性内切酶对染色体DNA进行部分酶切，建立基因文库。再用标记特异探针进行探测，确定目标基因片断，再进行克隆。.利用亚基因文库进行克隆先进行分子杂交，确定基因片断范围，在进行克隆筛选。放射免疫法 利用散弹法和表达载体建立基因表达文库；利用目标蛋白质制备抗体，对基因表达文库进行筛选，可直接获得完整的基因。利用简并引物的PCR方法 对目标基因的蛋白质进行N-端分析。根据AA序列设计简并引物，以基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得目标基因。转座子插入失活克隆法用Tn对目标生物进行突变，筛选突变株，抽提突变株基因组DNA，利用Tn序列信息设计特异探针，进行TAIL PCR双向扩增，从而获得完整基因。 质粒拯救法 利用带有复制起始位点（origin）的转座子进行诱变获得突变株，分离总DNA，酶解、连接、转化和测序（Gene trapping technique）功能克隆法（基因表达产物应用明显的表型效应） 利用目标基因表达产物的表型效应，从基因文库中筛选目标基因。通过双杂交系统克隆新基因 通过靶标蛋白利用双杂交系统克隆与该靶标蛋白作用的蛋白质基因。通过蛋白质组学技术克隆基因:通过肽片断序列获得蛋白质信息，从而在基因组中找到基因位置和序列，根据序列设计引物，扩增克隆该基因2原核生物表达所需基本元件，功能是什么？（1）启动子：Sextama box: 也称35序列,识别序列。其中心位于起始点上游大约35bp处。其共有序列为TTGACA.是RNA聚合酶识别序列的一部分（初始结合位点），RNA聚合酶依靠其亚基识别该位点。Pribnow box: 也称-10序列，在起始点的上游。其共有序列为TATAAT，碱基的保守性在45%到100%之间变动。是RNA聚合酶的牢固结合位点，在Pribnow框内DNA的双螺旋解链17个核苷酸左右，与RNA聚合酶形成所谓开放性启动子复合物，从而使RNA聚合酶定向，行使其转录功能。CAP位点：细菌中许多基因的表达存在一种正调控机制。细胞内缺少葡萄糖时，腺苷酸环化酶将ATP转变成cAMP, cAMP与其受体蛋白CAP结合成复合物，这个复合物再与启动子上的CAP位点结合。这样启动子上的进入位点方能与聚合酶结合。（2）终止子：一个或多个发夹结构，连续的6个U是RNA聚合酶从模板上解离下来的信号。 不依赖因子的终止子：回文序列中富含GC碱基对，在回文序列的下游方向又常有68个AT碱基对，会文序列下游紧连着又一串U。RNA聚合酶在转入延伸过程中遇到回文序列后会出现一次延宕，由于回文序列中富含GC，使得延宕时间延长，又由于回文序列下游的一串U使RNA聚合酶与模板的结合能力下降，从而使转录终止。 依赖因子的终止子：会文序列中GC含量较少，回文序列下游方向的序列没有固定特征。因子的活性形式为一六聚体，具有 NTPase活性。因子可能结合正在合成中的RNA链的5端，通过水解NTP放出的能量向3端移动，在RNA聚合酶发生延宕的时间内追赶上RNA聚合酶，后与RNA聚和酶相互作用而造成转录的终止。 （3）SD序列：核糖体结合位点。mRNA中5端富含嘌呤的短核苷酸序列,一般位于mRNA的起始密码AUG的上游510个碱基处,并且同16S rRNA 3端的序列互补。（4）起始密码子：AUG（5）终止密码子：UAG UAA UGA（6）调节基因：位于启动子的上游，编码调节蛋白，阻遏蛋白与操纵基因结合阻止基因表达，诱导蛋白结合在启动子区域，加强基因的表达。（7）操纵基因：与阻遏蛋白结合，终止转录。3设计从某一原核生物或真核生物克隆某一基因的技术路线原核生物：DNA片段制备-插入载体-转入寄主细胞-筛选真核生物：mRNA preparation - Reverse transcription in vitro - cDNA preparation - cDNAlibrary - Screening4无细胞蛋白合成体系有哪些，用途？无细胞蛋白合成体系是指没有完整的细胞，但是具备完整细胞所拥有蛋白质合成的酶系和因子。（1）大肠杆菌无细胞蛋白质合成系统：理论上任何遗传信息都可以在大肠杆菌体外表达体系中被翻译成多肽。E.coli体外表达系统耐受性高，用来合成标记的蛋白最合适不过。这种体系的弹性就非常大，可以加入许多其它优化成份以提高产率和提高溶解性。原核生物（2）麦胚无细胞蛋白质合成系统：由于内源的mRNA很少，这个系统可用于各种病毒、酵母、高等植物乃至哺乳动物蛋白的合成。这个体系要求RNA有帽子结构才能更好的翻译。此系统广泛用于放射标记多肽和蛋白的合成。合成量不太高，直到最近才通过延长合成时间的方式提高了产率。麦芽提取物系统和大肠杆菌系统都适合进行高通量的蛋白质组学研究。植物（3）兔网织红细胞无细胞蛋白质合成系统：网织红细胞由红细胞分化而来，在体内主要是负责合成大量血红蛋白（90%以上），以及球蛋白。这种未成熟的红细胞本身不带细胞核，但却保留了这种高效翻译各种核酸信息的能力，可减少背景，即使在较低的丰度下也能比较高效地合成产物。此外网织红细胞体系内源的核酸酶很少，有助于长链RNA的稳定（包括有帽子或者没帽子结构的RNA），因而可以合成较大的蛋白。网织红细胞体系是最有希望做到微粒体糖基化的体系。兔网织红细胞体系一般有2种，处理过和未处理过的。由于兔网织红细胞虽然没有细胞核，依然有内源球蛋白mRNA，可通过外加钙离子依赖的核酸酶处理除去内源球蛋白mRNA，并通过EDTA处理使核酸酶失活。经过处理的兔网织红细胞体外表达体系背景更低效率更高。未经处理的兔网织红细胞裂解物往往用来研究翻译机制，或者研究球蛋白翻译的抑制物等等。动物5限制性内切酶的作用特点是什么？答：根据酶的组成，识别和切割的位点及是否需要辅助因子可将限制性内切酶分为三类：类限性内切酶由3种不同的亚基组成，兼具有修饰酶活性和限制性内切酶活性。它能识别和结合于特定的DNA序列位点，去随机切割识别位点以外的DNA序列，作用需要Mg2+，S腺苷甲硫氨酸及ATP.类限制性内切酶占内切酶的绝大部分，由修饰酶和切割酶组成，识别回文对称序列，在回文序列内部或附近切割DNA双链，产生3-OH和5-P基团的DNA产物，反应需Mg2+，不需ATP.类限制性内切酶种类少，所占比例不到1，识别序列为5-7bp的非对称序列，在识别位点下游24-26bp处切割DNA，反应需ATP。R. E. type酶分子内切酶与甲基化酶分子不在一起三亚基双功能二亚基双功能酶识别位点4-6bp大多数为回文对称结构二分非对称5-7bp非对称切割位点在识别位点中或靠近识别位点无特异至少在识别位点外1000bp在识别位点下游24-26bp限制反应与甲基化反应分开的反应互斥同时竞争限制反应是否需要ATPNoYesYesDigestion types: 1. Same sequence/same sites 2. Same sequence/different site 3. Different or same sequence/different or same site不同限制性内切酶识别和切割的特异性不同，结果有3种情况：1.产生3突出粘性末端。2.产生5突出粘性末端，3.产生平末端，另外，有些限制性内切酶还具有星星活性，即在极端的条件下，如高PH值和低离子强度下，限制性内切酶可以切割类似但不同于其特定识别序列的序列。最常见的一类活性改变是允许碱基替代和识别序列中碱基的缺失。6Dpn用于定点诱变的原理是什么？方法答：限制性内切酶Dpn用于定点诱变是因为它所识别和切割的位点为TCGmATCG，而来自于大肠杆菌的质粒就具有这种序列。PCR扩增时，引物与预发生诱变的模板之间具有单个碱基的错配，扩增结果使错配进入到模板序列中。由于扩增产物不含有Dpn识别的甲基化位点，而原先的模板质粒DNA则具有这种位点，所以Dpn就会切割消化模板DNA，而新扩增的DNA则不会被消化。若再以扩增的DNA为模板合成其互补链，则互补链就为实现定点诱变的DNA。方法：1. 加热变性质粒DNA，然后退火使含有突变位点的引物与质粒DNA配对。 2热循环扩增渗入突变的引物，产生有缺口的环状链。 3用Dpn降解模板链 4将退火形成的有缺口的双链DNA分子转化到大肠杆菌XL1-Blue中 5XL1-Blue E. coli 细胞修复缺口，成为定点突变的质粒DNA7定点诱变有哪些方法，其原理是什么？（8P9）（1）异源双链法定点诱变预先设计含A B C3个不同的酶切位点的质粒，其中A B较近，C离A B较远，在B处设计有引物结合位点；对该质粒分别进行C酶切和A B酶切，核酶外切酶法定点诱变PCR介导：（1）单引物突变；（2）互补引物突变；（3）多引物突变（多位点诱变）；（4）饱和诱变定点诱变技术，可以人为地通过基因的改变来修饰、改造某一已知的蛋白质，从而可以研究蛋白质的结构及其与功能的关系、蛋白质分子之间的相互作用。8基因操作中最常用的修饰酶有哪些，适用于何处？工具酶答：基因操作中最常用的修饰酶有：（1）内切酶和外切酶（2）甲基化酶（每一种限制性内切酶都对应一种甲基化酶）甲基化酶可在其识别位点内引入甲基，用于保护DNA不被相应的限制酶所切割。通过甲基化修饰还可产生新的酶切位点。Dam甲基化酶可在GATC序列中的腺嘌呤N6位置上引入甲基。Dcm甲基化酶识别CCAGG或CCTGG，在第二个胞嘧啶C的C5位置上引入甲基。（3）连接酶T4 DNA连接酶可以催化DNA 5-P和3-OH之间形成磷酸二酯键，用于DNA 的粘性末端和平末端连接；E.coli DNA连接酶作用需NAD+的参与，常用于DNA的粘性末端连接和cDNA的克隆；T4 RNA连接酶可以催化ssDNA或RNA的5-P与另一ssDNA或RNA的3-OH之间形成共价连接，可用于标记DNA和RNA的3末端，单链DNA或RNA的连接。（4）DNA聚合酶（依赖于DNA的DNA聚合酶）大肠杆菌DNA聚合酶具有三种活性：53DNA聚合酶活性；53外切核酸酶活性；35外切核酸酶活性。利用其53外切核酸酶活性可用切口平移法标记DNA；用于cDNA克隆中的第二链；对3-突出末端的DNA作末端标记。Klenow DNA聚合酶具有聚合活性和35外切核酸酶活性，可补平有3凹端的DNA，对DNA进行末端标记，在cDNA克隆中合成第二链T4 DNA聚合酶与Klenow DNA聚合酶相似，35外切核酸酶活性更强，在诱变反应中很有用。T7DNA聚合酶与T4DNA聚合酶一样，用于长链合成Taq DNA聚合酶：且有聚合酶活性和35外切酶活性（5）T4多核苷酸激酶（PNK）：该酶主要用于对缺乏5-P的DNA或合成接头进行磷酸化（消耗ATP），同时可对末端进行标记（先去磷酸化ADP-ATP，再磷酸化ATP-ADP）。（6）碱性磷酸酶（小牛肠碱性磷酸酶，CIP）：该酶催化去除DNA或RNA的5-P，防止DNA片段的自身连接。用该酶后要进行纯化，避免残留，可凝胶电泳、回收。标记探针，增 加阳性克隆。（7）末端脱氧核苷酸转移酶：该酶催化dNTP加于DNA分子的3羟基端，可在cDNA或载体的3端加Poly(N)，用于克隆，Pu加Mg2+，Py加Co2+。用于3末端标记、构建PCR载体（+T），PCR产物通常多-A。（8）依赖于RNA的DNA聚合酶 AMV（骨髓细胞瘤病毒）反转录DNA聚合酶：cDNA合成；RNase H活性（pH8.3，对pH敏感） M-MLV（鼠白血病病毒）反转录酶：42失活。（9）依赖于DNA的RNA聚合酶（Sp6、T7、T3 RNA聚合酶，特异启动子）该酶为转录中的RNA合成酶，识别DNA中各自特异的启动子序列，无需引物。用于单链RNA探针；合成mRNA用于体外蛋白质合成；T7表达载体。（10）反转录酶用途主要有：做cDNA克隆；测转录起始点；5突出DNA的补平和标记；双脱氧终止法测序；RT-PCR等。（11）核酸酶Bal3核酸酶：主要活性为3外切核酸酶活性（Ca2+），可从线性DNA两条链的3端去除掉单核苷酸，达到两头缩短DNA的目的，用于缺失突变；也可用来制作DNA限制酶切图；单链外切酶活性（无Ca2+）S1核酸酶：可降解单链DNA或RNA，产生带5-P的单核苷酸或寡核苷酸双链，可用于分析DNARNA杂交体的结构，去掉突出的单链尾以产生平末端；降解发夹结构。脱氧核糖核酸酶可优先从嘧啶核苷酸的位置水解dsDNA 或ssDNA。可在切口平移标记时在dsDNA上随机产生切口；在闭环DNA上引入单切口；分析蛋白DNA复合物；除去RNA样品中的DNA核糖核酸酶H：可特异性水解与DNA杂交的RNA上的磷酸二酯键，不降解单链核酸，dsDNA or ds RNA,主要用于在cDNA克隆时合成第二链之前去除RNA，或除去mRNA 与Poly(T)退火后的Poly(A)尾巴。RNase A：DNA纯化小球菌核酸酶：在Ca2+作用下使复合体解离成核糖体和Nt，可用于依赖于mRNA的无细胞蛋白质合成体系。（12）DNA拓扑异构酶该酶通过瞬时破坏并再生磷酸二酯键，解除共价闭合环dsDNA中的超螺旋.（13）高保真DNA聚合酶：产生平头末端（14）低保真DNA聚合酶：体外分子进化（15）rTth反转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶活性（Mn2+）；依赖于DNA的DNA聚合酶活性（Mg2+）9T4 DNA聚合酶和Klenow fragment的特点（共同点，不同点）Klenow fragment的特点：具有5-3聚合酶活性和35外切酶活性。主要用途有：（1）补平经限制性核酸酶消化DNA所形成的3凹陷末端，包括带裂口的双链DNA的修复；（2）对带3凹陷末端的DNA分子进行末端标记；（3）在cDNA克隆中，用于合成cDNA第二链；（4）用于Sanger双脱氧末端终止法进行DNA的序列分析；（5）在单链模板上延伸寡核苷酸引物，以合成杂交探针和进行体外突变。T4 DNA聚合酶：外切酶活性比Klenow酶高1001000倍。35外切酶活性对单链DNA的作用比对双链DNA更强，因为后者受到聚合酶活性的影响。10作为载体的元件：特征（1）能在宿主细胞内进行独立和稳定的自我复制。含有在受体细胞内有效复制的质粒复制起始位点. （2）有合适的选择标记基因。是筛选的标志。理想的载体应该有两种选择标记基因（3）具有合适的限制性内切酶位点（有一段多克隆位点）。基因工程对载体的要求外源DNA插入其中不影响载体的复制。（4）构建质粒克隆载体DNA分子应分子量小。 （5）容易从宿主细胞中分离纯化。11如何构建穿梭载体、表达载体穿梭载体（Shuttle vector）是一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记，能够在两类不同宿主中复制、增殖和选择的载体。Ori E. coli / ori-virus(哺乳动物); E. Coli /杆状病毒（植物和昆虫）; E. Coli / G+; E. Coli / Yeast; E. coli / Ti plasmid表达载体：1）强启动子，一个可诱导的强启动子可使外源基因有效地转录 2）在启动子下游区和ATG上游区有一个好的核糖体结合位点序列（SD序列），促进蛋白翻译 3）在外源基因插入序列的下游区要有一个强转录终止序列，保证外源基因的有效转录和mRNA的稳定性。12如何设计E. coli严谨的控制表达系统Lac操纵子在无诱导物的情况下，负调节因子lacI基因产物与启动子下游的操作基因紧密结合，阻止转录的起始。在诱导剂IPTG存在的情况下，与阻遏蛋白结合后，导致与操纵基因的结合能力降低而解离出来，lac操纵子的转录因此被激活。用tac启动子构建的表达系统称为Tac表达系统。为了能使Lac和Tac表达系统具有严谨调控，一种能产生过量的lacI阻遏蛋白的lacI基因的突变体lacIq被应用于表达系统。但在使用高拷贝复制子构建表达载体时，仍能观察到较高水平的本底转录，还需在表达载体中插入lacIq基因以保证有较多的lacI阻遏蛋白产生。人们想到用阻遏蛋白lacI的温度敏感突变株lacI（ts）应用于Lac和Tac表达系统。这些突变体基因插入表达载体或整合到染色体后，均能使lac，tac启动子的转录受到温度严谨调控，在较低温度（30）时抑制，在较高温度（42）时开放。13什么叫质粒拯救？如何获得ori replicon等利用带有复制起始位点的转座子进行诱变获得突变株，分离总DNA，酶解，连接，转化和测序。质粒拯救技术是1981年由L. K. Millers首先用于研究昆虫核型多角体病毒（NPV）基因组位点突变的一种技术。其原理是利用野生型NPV DNA的限制酶切片段使突变型转变成野生型。这个转变过程可能是一种普通的遗传学同源重组或基因转变，在遗传学上又称为等位取代。在图谱ts突变位点时，把突变体的DNA分N1与许多野生型病毒DNA限制性片段共转染，其中将会有“个片段“拯救”该突变体（即使该ts突变为野生型）。因此，在限制温度条件下就会形成野生型的空斑。能拯救一个ts的片段就是ts的突变位点。用此方法Miller已精确地把7个ts突变位点找了出来。14整合目的DNA到载体上 如何实现目的DNA整合到染色体DNA上 一类是借助载体（重组的动植物病毒、反转录病毒、农杆菌Ti质粒或Ri质粒）；一类不需借助于载体（动物：磷酸钙沉淀法、脂质体介导法、血影细胞介导法、电转移法、DNA微注射法、精子载体法、胚胎干细胞介导法、DEAE-葡聚糖转染法、基因同源重组法；植物：基因枪法、花粉管通道法、PEG法、电击法、显微注射法、浸渍法）。 在生物学研究和基因工程应用中，会涉及将某个基因或某些基因插入到染色体中去的工作，承担这部分工作的载体，可称为整合载体（integration vector）。根据整合方式的不同可分为定点整合和随机整合，按其作用来分可归为目标基因的插入或敲除以及随机突变体库的构建。1基因插入 / 基因敲除 同源重组整合载体是最常用的整合载体，该载体一方面含有大肠杆菌克隆载体的骨架，更主要的是含有一段便于同源重组的重组 DNA 片段。也就是从染色体上待插入位点处取出一段 DNA, 将选择标记基因和多克隆位点插入到这个片段中间得到这一重组 DNA 片段。2随机插入突变载体随着功能基因组研究的发展，不断需要一系列发生基因突变的材料。为了满足这一要求，构建随机突变体库便进入到研究工作中。随机突变体库是指标记基因在载体的携带下通过 DNA 重组事件随机插入基因组中而形成的突变体的集合。 为了提高标记基因插入到基因组中的频率，一般都要借助转座子来帮忙。基因定点整合技术又称为基因打靶是指构建含有同源序列的片段的整合载体，通过各种转化方法，使外源序列与靶序列之间发生同源重组，从而将靶序列定点破坏，通过一系列筛选手段，最终得到定向转化的细胞。所谓同源重组，基因定点整合方式有三种解释。1普遍接受的观点是基因定点整合是由于转化片段两侧同源序列与靶列之间发生双交换而产生2有证据表明还存在着另外一种整合方式，观察到在酵母的一类转化事件中有扇形突变菌落产生，这种现象在修复系统突变的个体中更加明显。用上述观点无法解释这种现象，因为在双交换中外源两侧同源序列都应该与靶DNA整合在一起，不会产生扇形突变菌落。故此，B0+2C 等提出另一种解释，这种现象的发生，是由于外源DNA 一侧的同源序列与靶DNA序列退火，形成一种异源双链的中间体，之后再进行复制。该异源双链结构往往会被细胞内的修复体系删除或纠正，因为体内的错配修复体系更倾向于使用自己本身已有的且没有断裂的DNA链，使用外源的DNA链的几率仅有5%。3 外源DNA同源序列与靶DNA配对并作为引物诱导互补链的合成。实验表明在含有着丝粒的外源DNA序列两侧分别加上染色体某一位点的正向序列与反向序列，即构建成等臂染色体片段载体，将此载体转化酵母，转化后筛选阳性克隆，得到含等臂染色体的转化株，即在转化株的外源转化DNA片段两端是同一染色体臂的两个拷贝。这是由于所转化的DNA 两侧的3端作为引物侵入染色体中，引起新链的合成在载体中加入真核DNA 的转座子,可以提高非病毒载体的整合效率。转座子能使基因方便地从这一染色体转移到另一染色体上,效率较高。Tc1/水手(mariner) 超科转座子6 由“剪切粘贴”机制完成,需要连接酶、转座酶共同作用来缩短该转座子侧面的反转重复序列。这些转座子大多都整合到复制后的TA 二核苷酸中。与转座可在体外发生、转座酶独立于宿主因素起作用的假设一致,水手类及Tc1 类转座子已用于蚊子、斑马鱼及鸡胚胎的微注射,并生成了非哺乳转基因动物。睡美人( sleeping beauty) 转座子7 是一种合成转座子,来源于Tc1 类鱼元件的缺陷复制。它可以使外源基因插入脊椎动物细胞、小鼠胚胎干细胞及人类细胞的染色体中。15如何检测目的基因已经插入宿主的染色体？1) 根据重组载体的标志进行鉴定克隆载体中都带有用于筛选的标志基因，利用这些标志可以筛选获得阳性重组子。克隆载体携带的最常见标志是耐药性标志。若外源记忆内插入在抗性基因外部，在含有抗生素的培养基中，只有携带相应耐药性基因载体的细胞才能生存繁殖，而未能接受载体DNA的细胞则全部被筛除掉。如果外源怒地基因插入在载体的耐药性基因内部，该耐药性基因被插入失活，则含有目的基因的阳性重组子就回丢掉此种抗性。IPTG诱导X-gal显色选择，重组菌白色菌落，非重组蓝色。2) DNA限制性内切酶图谱分析目的序列插入载体会使DNA限制性酶图谱发生变化。利用这种变化可以鉴定插入序列。通常利用重组时的酶切割重组子DNA，若获得与目的基因一致的片段即证明重组子中含有插入序列。3) 核酸杂交法：利用标记的核酸做探针与转化细胞的DNA进行分子杂交，可以直接筛选和鉴定含有目的基因的阳性克隆。常用的杂交方法包括菌落原位杂交、Southern杂交。菌落原位杂交直接将转化后生长的菌落复印到硝酸纤维素膜上，经碱裂解后，将菌落释放的DNA原位吸附在没上，再与标记的核酸探针温育杂交，核酸探针就结合在含有目的基因的菌落DNA上而不被洗脱，待显色后就可以将含有目的序列的菌落挑选出来。4) PCR法 :如果已知目的基因的长度和两端的序列，设计合成一对引物，以转化生长的质粒DNA为模板进行扩增，挑选出PCR产物，与预期长度相符的克隆，可能就是含有目的序列的重组子。5) 免疫学方法 :通过特定的标记抗体与基因表达产物的反应指示含有目的基因的转化细胞，因而要求目的基因进入受体细胞后能够表达。利用标记抗体的酶可催化特定的底物反应而呈现颜色变化，可以指示含有目的基因的克隆位置。6) 核酸序列测定7) 绿色荧光蛋白（GFP）标记8) 通过检测绿色荧光蛋白来鉴定目的基因是否已经插入。8）凝胶电泳16如何制备RNA探针，及注意事项？DNA探针将需要制备的目的基因的一小段寡核苷酸序列，插入到含有T7或SP6启动子的载体上，并处于启动子下游；再利用限制性内切酶进行切割得到线性DNA分子，然后加入RNA聚合酶、NTP和标记物，进行体外转录得到标记的小分子RNA探针。这种方法可以快速制备各种标记（同位素、非放射性标记均可）的小于100nt的小分子RNA探针，适用于Northern 和原位杂交等。注意事项：（1）制备单链探针时的正应注意插入方向确性。（2）外源基因插入后应线性化。常见DNA探针制备方法则有缺口平移，随机引物法，单链探针，末端标记（Klenow fragment、T4 DNA聚合酶标记3端、激酶标记5端、末端转移酶标记3）等17要实现某一基因在异源宿主中表达，如何构建载体？ 1) 选择合适的复制起点，翻译起始序列不同会影响起始效率 2）报告基因 3）启动子（强度，宿主专一性） 4）密码子的选择：受体对密码子的选择 5）终止子18影响基因表达的因素有哪些？启动子强度；转录终止子；质粒拷贝数；转录起始序列；密码子偏爱性；mRNA结构（序列稳定性和半哀期）；寄主生理条件（蛋白酶活性）19试述构建基因文库的基因策略基因组 DNA 文库的构建程序包含 5 个部分： 载体的制备； 高纯度大分子量基因组 DNA （High molecular weight DNA, HMW DNA）的提取； HMW DNA 的部分酶切与脉冲电泳分级分离（PFGE size selection）； 载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞； 重组克隆的挑取和保存。图 8-1 为构建 BAC 文库的基本程序。构建噬菌体文库如 P1 等的程序稍有不同，连接产物不用电转化的方法转化宿主，而是采用包装蛋白进行包装并侵染宿主。.基因组 DNA 文库的载体制备载体的好坏是影响连接成功与否的关键，载体的制备要求两点，一是纯度高；二是去磷酸化好。.高质量大分子量基因组 DNA 的提取和部分酶切 构建不同大小插入片段的基因组文库对 DNA 质量要求不同，一般所提取的 DNA 分子量至少应该是文库最终平均插入片段长度的 35 倍。实践表明，提取的基因组 DNA 分子量越大，所得到的重组克隆的插入片段越大。.文库的连接转化或包装侵染 一般在构建大片段基因组 DNA 文库时，大量连接前都要先使用小体系连接来寻找最适的比例。在电转化和包装侵染过程中，首先最好选择转化效率高的进口感受态细胞或效价高且质量稳定的包装蛋白，同时，研究表明对连接产物进行脱盐处理也可以明显地提高其效率。另外，对于电转化而言，选择合适的转化电压对不同插入片段的 DNA 的转化效率也有所不同。. 文库的质量检测 在文库的质量检测中，除了克隆子数目是可以确定的，其它值都是估算的。文库的平均插入片段长度是通过 PFGE 电泳检测一定数目的重组子的插入片段大小所得平均值。美国的研究机构对 BAC 文库，一般要求植物的在 130kb 左右，而动物的在 150kb 左右。插入效率也是通过此法检测的，表示有插入片段的克隆在所有检测的克隆中所占的比例。基因组覆盖倍数的计算方法一般包括两个过程，一是计算法，基因组覆盖倍数平均插入片段长度克隆数/基因组 DNA 的长度（一般是约数）；另一种算法是结合基因组覆盖度的检测来进行的。基因组覆盖度是指文库中的克隆覆盖基因组的范围，检测时是通过选择一定数目的已知的单拷贝的基因作探针来筛选文库。由于所使用的每个探针筛选的克隆数目即表明文库中对该基因位点的覆盖倍数，因此，基因组覆盖倍数又等于所有探针筛到的阳性克隆的总个数/使用的总探针数的比值。（质量优良的基因文库的代表性与基因文库的大小，即克隆数多少呈正相关）. 基因文库的扩增、分装及保存20Southern Northern Western 的原理及应用。答：核酸分子杂交是指非同一分子来源但具有互补序列（或某一区段互补）的两条多核苷酸链，通过碱基配对形成稳定的双链分子的过程。若其中的一条链被人为标记上，该标记可以通过某种特定方法检出，即成为所谓的探针。探针与其互补的核苷酸序列杂交后，杂交体也就带上了同样标记，可被检测出来。这样，以特定的已知核苷酸序列做探针，就可以在诸多的核苷酸序列中，通过杂交探测出与其互补的序列，因而分子杂交是进行核酸序列分析，重组子鉴定及检测外源基因整合表达的强有力手段。它具有灵敏性高（可检出10-12g，即1pg DNA样品）、特异性强（可鉴别出20个碱基对左右的同源序列）的特点，是当前鉴Southern杂交是以DNA或RNA为探针，检测DNA链，用于外源基因整合的鉴定及分析。Southern杂交可用来检测经限制性内切酶切割后的DNA片段中是否存在与探针同源的序列，不仅可鉴定外源基因的整合，还可初步鉴定插入的拷贝数Northern杂交是以DNA或RNA为探针，检测RNA链，用于外源基因转录产物特异mRNA 的检测，是外源基因转录水平的鉴定方法。Western杂交是利用抗原与抗体特异结合的原理，检测外源基因表达的蛋白质的生成，是外源基因表达水平的鉴定方法。21杂交技术包括哪几种？各有何优缺点？酵母双杂交：酵母双杂交系统的最主要的应用是快速、直接分析已知蛋白之间的相互作用及分离新的与已知蛋白作用的配体及其编码基因。酵母双杂交系统又分为酵母细胞核杂交系统和酵母细胞质杂交系统。优点: 1.作用信号是在融合基因表达后， 在细胞内重建转录因子的作用而给出的， 省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。2.检测在活细胞内进行， 可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。3.检测的结果可以是基因表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。4.酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库， 能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。缺点： 1.酵母双杂交系统需要很长的扩增周期，筛选一轮大概需要一个月。2. 随后的克隆步骤需要通过大肠杆菌寄主进行，酵母DNA的操作需要很高的技术。3. 酵母细胞的转化效率很低。建库筛选时多样性比核酸水平大大降低，因而需要更大的容量。4. 酵母细胞中有许多真核同源序列，一些真核的调控蛋白有可能对酵母细胞产生毒害，假阳性和假阴性问题比较严重。细菌双杂交：优点：1. 研究周期短，操作简单。传统的酵母双杂交系统需要六天或更久才可得到结果，而大肠杆菌双杂交系统只需不到一天的时间。另外，使用大肠杆菌双杂交系统时，分离和扩增质粒都非常简单。2. 能够产生容量更大的文库。就目前的方法而言，酵母细胞的转化效率只能达到106cfu/gDNA，而大肠杆菌细胞可达到109cfu/gDNA。3. 更低的假阳性率和假阴性率。大肠杆菌的遗传体系有更小的基因组复杂性，与高等真核生物相比，又具有更大的进化距离。从而，避免了在研究真核生物蛋白相互作用时，由酵母内源蛋白所引起的假阳性和假阴性现象。4. 一些真核的调控蛋白有可能对酵母细胞产生毒害，而同样的情况发生在大肠杆菌中的可能性会小得多。5. 采用大肠杆菌作为筛选宿主，还能够避免传统酵母双杂交系统对于核定位的要求。6. 更好的小分子药物筛选宿主。用酵母双杂交系统进行小分子药物的筛选时，一个关键的局限因素在于药物对于酵母细胞膜的可渗透性。然而，大肠杆菌细胞对于这些小分子药物的通透性要好得多缺点：大肠杆菌不具有翻译后的加工修饰功能，限制了它的应用。22PCR在分子生物学领域的应用。1）PCR产物的平末端克隆。靶基因经PCR扩增，样品经必要的纯化回收后，接下来用平末端进行连接克隆也是分子生物学实验中常规采用的技术路线。这种连接方法是相当有效的，因为线性载体DNA分子的产生，连结和PCR扩增DNA片段的末端补平几种酶催化反应，在同一个反应体系中几乎同时进行。2）克隆化的PCR产物连入T载体。有Taq DNA聚合酶PCR扩增产生的3突出末端为A碱基的DNA片断能高效的克隆至T载体上。这种T载体有与A碱基互补配对的3T碱基。3）通过PCR扩增在扩增DNA产物末端引入限制性核酸内切酶酶切位点。用于PCR扩