课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,选修1专题2课题2,一、研究思路,（一）筛选菌株,1.实例：PCR技术：一种在体外将少量DNA大量复制的技术。此项技术要求使用耐高温的DNA聚合酶。,提出的问题如何寻找耐高温的DNA聚合酶？,解决问题的思路寻找耐高温环境。,原因：高温条件淘汰了绝大多数微生物。,获得启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。,2.实验室微生物的筛选原理,人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。,本课题使用的培养基KH2PO41.4gNaHPO42.1gMgSO4.7H2O0.2g葡萄糖10.0g尿素1.0g琼脂15.0g将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1000mL。,碳源：葡萄糖、尿素,氮源：尿素,能。只有产生脲酶的细菌才能利用尿素作为氮源而生存。,3.选择培养基,问题1：该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？,问题2：此配方能否筛选出产生脲酶的细菌？为什么？,在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养基。,加入青霉素的培养基,（1）概念：,（2）例子：,细菌不生长，酵母菌、霉菌等真菌能生长。,不加含碳有机物的无碳培养基,分离自养型微生物。,【典型例题】,用来判断选择培养基是否起到了选择作用需要设置的对照是()A.未接种的选择培养基B.未接种的牛肉膏蛋白胨培养基C.接种了的选择培养基D.接种了的牛肉膏蛋白胨培养基,d,【典型例题】,选择培养基是根据某一种或某一类微生物的特殊营养要求或对一些物理、化学抗性而设计的培养基。利用这种培养基可以将所需要的微生物从混杂的微生物中分离出来。为选择酵母菌和硝化细菌，应选用的培养基分别为()A.伊红美蓝培养基、含青霉素培养基B.含青霉素培养基、含氨的无机培养基C.含氨的无机培养基、含青霉素培养基D.含青霉素培养基、伊红美蓝培养基,B,（二）统计菌落数目,1.显微镜直接计数,(1)原理:利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。,(2)具体做法：,（3）优缺点：,缺点：不能区分死菌和活菌。,优点：能准确统计微生物的实际数目。,每一个大方格边长为1mm，则每一大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的容积为0.1mm3。,以一个大方格有25个中方格的计数板为例进行计算：设五个中方格中总菌数为A，菌液稀释倍数为B，一个大方格中的总菌数是多少?,5A,1ml菌液中的总菌数?(1ml=1cm3=1000mm3）,5AB104,1mm,2.间接计数（活菌计数法）,C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(m)，M代表稀释倍数。,当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。,（2）原理：,稀释涂布平板法。,（1）常用方法：,计算公式：,每克样品中的菌落数(CV)M,【例1】某同学在稀释倍数为106的培养基上测得平板上的菌落数的平均值为234，那么每毫升样品中菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL）（）A.2.34108B.2.34109C.234D.23.4,（3）计数,【解析】稀释倍数为106，0.1mL稀释液的菌落数的平均值为234，则每毫升样品中菌落数就为234/0.1106=2.34109。,B,1.土壤取样,3.样品稀释、取样涂布,4.微生物的培养、观察并记录结果,5.细菌的计数,二、实验设计,1.土壤取样,从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。,牛肉膏蛋白胨培养基作为对照，判断选择培养基是否起到选择作用。,选用稀释倍数为103107的稀释液。每个稀释度下需要3个选择培养基（平行重复原则），1个牛肉膏蛋白胨培养基，共需要制备5个牛肉膏蛋白胨培养基和15个选择培养基，准备好无菌试管和移液管。,3.样品稀释、取样涂布,测定土壤细菌数量，一般选用104、105和106倍的稀释液进行平板培养；测定放线菌的数量，一般选用103、104和105倍稀释液；测定真菌的数量，一般选用102、103和104倍稀释液。,因为土壤中各类微生物的数量是不同的，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。,将10g土样加入盛有90mL无菌生理盐水的锥形瓶中,充分摇匀，吸取上清液1mL，转移至盛有9mL水的无菌试管中，依次等比稀释至107稀释度，并按照由107至103稀释度的顺序分别吸取0.1mL进行平板涂布操作。按照浓度从低到高的顺序涂布平板，不必更换移液管。,注意：由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为103107。,4.微生物的培养、观察并记录结果,将涂布好的培养皿放在30下培养。比较牛肉膏培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录。,不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在3037的温度下培养12d；放线菌一般在2528的温度下培养57d；而霉菌一般在2528的温度下培养34d。,一般来说，在一定的培养条件下(相同的培养基、温度及培养时间)，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如菌落形状、大小、隆起程度和颜色。,5.细菌的计数,当菌落数目稳定时，选取菌落数在30300的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。,【典型例题】,下列有关“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验”的叙述，正确的是（）A.分解尿素的细菌能产生脲酶，将尿素分解产生氮气B.将实验组和对照组平板倒置，25恒温培养2448小时C.统计尿素分解菌的数目时，以菌落数在300以上的平板进行计数D.用尿素为唯一氮源、加有酚红指示剂的培养基培养尿素分解菌，指示剂变红,D,【变式训练】,下列关于“检测土壤中细菌总数”实验操作的叙述中，不正确的是()A.用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高压蒸汽灭菌后倒平板B.取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1mL涂布到不同平板上培养C.将实验组和对照组平板倒置，37恒温培养2448小时D.确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的平板进行计数,D,【方法点拨】一般选择菌落数在30300间的平板进行计数,【课堂小结】,一、选择培养基的成分：,分解尿素细菌的分离与计数,尿素作为唯一的氮源。,二、鉴定方法：,在培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变红，pH升高，说明细菌能分解尿素。,三、统计菌落数目的