5.酵母核糖核酸的分离及组分鉴定ppt课件

实验四酵母RNA的分离及其组分鉴定,（离心技术）,实验目的,1、学习稀碱法提取酵母RNA粗制品的原理和方法。2、了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分的方法。3、学习离心机的使用方法。,离心机原理和应用,离心就是利用离心机转子高速旋转产生的强大的离心力，加快液体中颗粒的沉降速度，把样品中不同沉降系数和浮力密度的物质分离开。rpmrevolutionsperminute每分钟转数RCF-Relativecentrifugalforce相对离心力，是指在离心场中，作用于颗粒的离心力相当于地球重力加速度g的倍数4000rpm4000gRCF=1.119105(rpm)2r其中r表示离心机转轴中心与离心管中心的距离单位为cm。由于离心管的位置由转子（rotor）决定，因此r必须由查阅相关转子的参数而得。使用注意：配平！离心参数调节：转头，转速和离心时间,核糖核酸（Ribonucleicacid，RNA）,由核糖核苷酸通过磷酸二酯键连接而成的一类核酸,因含核糖而得名。RNA的种类：mRNA，tRNA和rRNA，另外snRNA（2006年诺贝尔医学奖）。,核苷-5-磷酸,酵母细胞富含核酸，且核酸主要是RNA，含量为干菌体的2.67%-10.0%，而DNA含量仅为0.03%-0.516%。工业上制备RNA多选用成本低、适于大规模操作的稀碱法或浓盐法。这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备单核苷酸的原料，其工艺比较简单。应用领域：调味品和食品添加剂,实验原理,稀碱法是用氢氧化钠使酵母细胞壁变性、裂解，离心除去蛋白质和菌体后，上清液用乙醇使RNA沉淀，由此即得到RNA粗制品。RNA含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分，加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以鉴定上述的组分。,RNA组份鉴定,（1）嘌呤碱与硝酸银作用产生白色的嘌呤银化合物沉淀。（2）苔衣酚显色法：核糖核酸与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核糖继而转变为糠醛，后者与苔衣酚（3，5-二羟基甲苯）反应呈鲜绿色，该反应需用三氯化铁或氯化铜作催化剂。（3）磷酸与定磷试剂中的钼酸铵作用生成磷钼酸，并被Vc还原成蓝色的的复合物钼蓝。,实验仪器,1.研钵2.水浴锅3.量筒4.滴管5.试管及试管架6.烧杯7.离心机8.锥形瓶,试剂和材料,1.0.04mol/L氢氧化钠溶液6.定磷试剂2.三氯化铁浓盐酸溶液7.酸性乙醇溶液3.0.1mol/L硝酸银溶液8.苔黑酚乙醇溶液4.1.5mol/L硫酸溶液9.酵母粉5.浓氨水,操作步骤,（一）酵母RNA粗制品的提取,1、将酵母片在研钵中研磨均匀，称取4g酵母粉悬于30mL0.04mol/LNaOH溶液中(锥形瓶)。在沸水浴上加热30分钟后，冷却。2、4000r/min离心5分钟后，分成上清和沉淀两层，沉淀主要成分就是变性的蛋白质，RNA包含在上清中。,3、将上清液缓缓倾入30mL酸性乙醇溶液中。注意要一边搅拌一边缓缓倾入。待核糖核酸沉淀完全后，离心（4000rpm）5分钟。弃去上清液。,注：离心前，离心管（包含转头）一定要对称的两管在天平上配平，第一次用NaOH溶液，第二次用酸性乙醇。两次使用的胶头滴管要分开放置,（二）组分鉴定,1、水解：提取的核酸溶解于10mL1.5mol/L硫酸溶液中，在沸水浴中加热10min制成水解液，进行组分的鉴定。,2.嘌呤碱：取一只试管，加入1ml水解液，加入过量的浓氨水（用胶头吸管吸2管约2ml），再加入1ml0.1mol/L硝酸银，观察有无白色嘌呤碱的银化合物沉淀生成。,嘌呤银络合物在碱性条件下易形成白色絮状沉淀。,3.核糖：取一只试管，加入水解液1ml，三氯化铁浓盐酸溶液2ml，加入苔黑酚乙醇溶液0.2ml，放入沸水浴中5min。注意溶液是否变墨绿色。,核糖在浓盐酸中，与苔黑酚（3，5-二羟甲苯）及三氯化铁盐酸试剂共热，产生绿色的络合物。,4.磷酸：取一只试管，加入水解液1ml和定磷试剂1ml，在沸水浴中加热。观察溶液是否变成蓝色。,磷酸与钼酸铵试剂作用产生磷钼酸，磷钼酸在还原剂抗坏血酸(Vc)的作用下形成蓝色复合物钼蓝。,1.稀碱法提取的RNA为变性RNA，可用于RNA组分鉴定及单核苷酸制备，不能作为RNA生物活性实验材料。2.苔黑酚反应特异性较差，凡戊糖均有此反应。因此地衣酚实验不能作为RNA与DNA鉴别的依据。3.试剂瓶中溶液用胶头滴管取用，吸1管约为1毫升，0.2ml用胶头滴管取4滴即可