双水相萃取的技术goodPPT课件

-,1,双水相萃取技术,1.1双水相系统1.2双水相中的分配平衡1.3影响物质分配平衡的因素1.4双水相系统的应用,-,2,1.1双水相系统,基因工程产品如蛋白质和酶往往是胞内产品，需经细胞破碎后才能提取、纯化，细胞颗粒尺寸的变化给固液分离带来了困难，同时这类产品的活性和功能对pH值、温度和离子强度等环境因素特别敏感。由于它们在有机溶剂中的溶解度低并且会变性，因此传统的溶剂萃取法并不适合。采用在有机相中添加表面活性剂产生反胶束的办法可克服这些问题，但同样存在相的分离问题。,-,3,有机溶剂萃取的不足：许多蛋白质都有极强的亲水性，不溶于有机溶剂;蛋白质在有机溶剂相中易变性失活。,双水相萃取的优点:使固液分离和纯化两个步骤同时进行，一步完成；适合热敏物质的提取，主要是胞内酶；亲水性聚合物加入水中，形成两相，在这两相中，水分都占大比例（8595），这样生物活性蛋白质在两相中不会失活，且以一定比例分配于两相中。,-,4,聚合物的不相溶性(incompatibility)：当两种高分子聚合物之间存在相互排斥作用时，由于相对分子质量较大，分子间的相互排斥作用与混合过程的熵增加相比占主导地位，一种聚合物分子的周围将聚集同种分子而排斥异种分子，当达到平衡时，即形成分别富含不同聚合物的两相。这种含有聚合物分子的溶液发生分相的现象称为聚合物的不相容性。可形成双水相的双聚合物体系很多，如聚乙二醇(polyethyleneglycol,略作PEG)/葡聚糖(dextran，略作Dx)，聚丙二醇(polypropyleneglycol)/聚乙二醇和甲基纤维素(methylcellulose)/葡聚糖等。双水相萃取中常采用的双聚合物系统为PEG/Dx，该双水相的上相富含PEG，下相富含Dx。除双聚合物系统外，聚合物与无机盐的混合溶液也可形成双水相。,-,5,双水相体系,-,6,a,双节线,系线,b,双节线,均相区,均相区,两相区,两相区,系线,临界点,图分别为PEG/葡萄糖(Dx)和PEG/磷酸钾(KPi)系统的典型相图,-,7,在系线上各点处系统的总浓度不同，但均分成组成相同而体积不同的两相。两相的体积近似服从杠杆规则，即,系线的长度是衡量两相间相对差别的尺度，系线越长，两相间的性质差别越大，反之则越小。当系线长度趋向于零时，即在图b的双节线上K点，两相差别消失，任何溶质在两相中的分配系数均为1，因此K点称为临界点(criticalpoint)。,-,8,1.2双水相中的分配平衡,与溶剂萃取相同，溶质在双水相中的分配系数也用m=c2/c1表示。为简便起见，用c1和c2分别表示平衡状态下下相和上相中溶质的总浓度。生物分子的分配系数取决于溶质与双水相系统间的各种相互作用，其中主要有静电作用、疏水作用和生物亲和作用等。,lnm=lnme+lnmh+lnml,-,9,1.2.1静电作用,-,10,-,11,实际的双水相系统中通常含有缓冲液和无机盐等电解质，当这些离子在两相中分配浓度不同时(即分配系数1)，将在两相间产生电位差，此时，荷电溶质的分配平衡将受相间电位的影响，从相平衡热力学理论推导溶质的分配系数表达式为,lnm=lnmo+FZ/RT,因此，荷电溶质的分配系数的对数与溶质的净电荷数成正比,由于同一双水相系统中添加不同的盐产生的相间电位不同，故分配系数与静电荷数的关系因无机盐而异.,-,12,1.2.2疏水作用,PEG/Dx和PEG/无机盐等双水相系统的上相(PEG相)疏水性较大，相间的疏水性差用疏水性因子HF(hydrophoblcfactor)表示。HF可通过测定疏水性已知的氨基酸在其等电点处的分配系数maa测算,lnmaa=HF(RH+B),其中，RH为氨基酸的相对疏水性(relativehydrophobicity)，是通过测定氨基酸在水和乙醇中溶解度的差别确定的，并设疏水性最小的甘氨酸的RH0。所以上式中B为,B=lnmGly/HF,-,13,pHpI时氨基酸在双水相系统中的分配系数与其RH值呈线性关系，直线的斜率就是该双水相系统的HF值。,-,14,如果在pH为等电点的双水相中蛋白质的分配系数(m0)与HF值之间呈线性关系，则直线的斜率定义为该蛋白质的表面疏水性，用HFS(hydrophobicfactorofsolutes)表示,lnm0=HFHFS,盐浓度对血红蛋白分配系数的影响PEG/Dx,pH=pI;NaCl(mol/kg):()0;()0.6;()1;()2,从实验结果可知,蛋白质的表面疏水性HFS随添加NaCl浓度的增大而增大.将盐对蛋白质疏水性的影响引入上式，则,lnm0=HF(HFS+HFS),式中，HFS为盐浓度增加引起的HFS值增量。因此：,lnm=HF(HFS+HFS)+FZ/RT,该式较全面地描述了双水相系统的疏水性和相间电位、蛋白质的疏水性和净电荷数对分配系数的影响，同时也间接地通过盐对蛋白质表面疏水性和相间电位的影响表现了盐对蛋白质分配系数的作用。,-,15,1.3影响物质分配平衡的因素,聚合物的分子量聚合物的浓度,分子量越小，蛋白质容易分配于富含该聚合物的相中。,当接近分配的临界点蛋白质均匀分配于两相中，分配系数接近1；成相聚合物的总浓度或聚合物/盐浓度的比例增加时，系统远离平衡点，此时两相性质的差别增加，蛋白质容易趋向于某一极。,-,16,3.盐的种类和浓度4.pH值5.温度,盐的种类(离子组成)影响蛋白质、核酸等生物大分子的分配系数，盐浓度不仅影响蛋白质的表面疏水性，而且扰乱双水相系统，改变各相中成相物质的组成和相体积比。,pH值影响蛋白质的解离度，调节pH值可改变蛋白质的表面电荷数，从而改变分配系数。,温度影响双水相系统的相图，因而影响蛋白质的分配系数。但一般来说，当双水相系统离双节线足够远时，温度的影响很小，12度的温度改变不影响目标产物的萃取分离。,-,17,目前已知的胞内酶约2500种，但投入生产的很少。原因之一是提取困难。胞内酶提取的第一步系将细胞破碎得到匀浆液，但匀浆液黏度很大，有微小的细胞碎片存在，欲将细胞碎片除去，过去是依靠离心分离的方法，但非常困难。双水相系统可用于细胞碎片以及酶的进一步精制。,1.双水相萃取法常用于胞内酶提取,1.4双水相萃取的应用,-,18,利用双水相从细胞碎片中提取胞内酶的典型例子,-,19,双水相萃取技术在其它分离过程中的应用,-,20,细胞匀浆液,+PEG/盐（或葡萄糖）,PEG/盐或PEG/Dx萃取系统,相分离,下相,上相（PEG),(细胞碎片，杂蛋白，多糖，核酸）,（目标产物，杂蛋白，多糖，核酸）,+盐,PEG/盐萃取系统,相分离,下相,上相（PEG),（杂蛋白，多糖，核酸）,（目标产物）,+盐,PEG/盐萃取系统,下相,（杂蛋白，盐）,相分离,上相,（PEG，目标产物）,三步萃取流程示意图：,-,21,要成功地运用两水相萃取的方法，应满足下列条件：欲提取的酶和细胞应分配在不同的相中；酶的分配系数应足够大，使在一定的相体积比时，经过一次萃取，就能得到高的收率；两相用离心机很容易分离。,-,22,2.双水相反应,在双水相系统中进行转化翻译功能，如酶促反应，可以把产物移入另一相中，消除产物抑制，因而提高了产率。这实际上是一种反应和分离耦合的过程，有时也称为萃取生物转化；如果发生的是一种发酵过程，则也称为萃取发酵，因而此时也可以把双水相系统称为双水相反应器。,-,23,要进行两水相生物转化反应应满足下列条件：催化剂应单侧分配；底物应分配于催化剂所处的相中；产物应分配在另一相中；要有合适的相比。如产物分配在上相中，则相比要大，反之则相比要小。,这些条件不可能同时满足，分配理论也不完