《PCR技术简史》PPT课件

PCR技术简史,1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明PCR基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖,引物,引物,Mullis的构思,DNA聚合酶,DNA聚合酶,94变性,50-65退火,72延伸,72,94,55,PCR循环,PCR的反应体系,TaqDNA聚合酶,酶活性(%),温度(),405060708090100,10080604020,PCR的基本原理,重复13步2530轮,目的DNA片段扩增100万倍以上,DNA双螺旋,DNA单链与引物复性,DNA变性形成2条单链,子链延伸DNA加倍,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,模板DNA,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,引物1,引物2,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,引物1,引物2,Taq酶,Taq酶,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,第1轮结束,第2轮开始,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,Taq,Taq,Taq,Taq,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,第2轮结束,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,模板DNA,第1轮扩增,第2轮扩增,第3轮扩增,第4轮扩增,第5轮扩增,第6轮扩增,PCR的特点,灵敏度高简便、快速对标本的纯度要求低，血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA。,引物设计引物长度以15-40bp为宜碱基尽可能随机分布，G+C占50-60%引物内部避免形成二级结构两引物间避免有互补序列,模板浓度一般为100ng/100L,浓度过高会导致反应的非特异性增加。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白。,PCR反应条件,引物浓度0.1-0.5mol/L，浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。TaqDNA聚合酶0.5-2.5U/50l，酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。,四种dNTP浓度应相等Mg2+是DNA聚合酶的激活剂0.5mmol/L2.5mmol/L,循环参数变性：95oC，20-30秒。退火：温度由引物长度和GC含量决定5060oC。延伸：70-75oC循环次数：25-35次。,PCR的类型和应用,多重PCR,用于检测特定基因序列的存在或缺失。,电泳,引物,LP-PCR（Labelledprimers),利用同位素、荧光素等对引物进行标记，用以直观地检测目的基因，可同时检测多种基因成分。,病毒1病毒2病毒3病毒4,标记引物,观察,PCR产物,PCR技术的应用,基因克隆,5,5,BamHI,BamHI,BamHI,BamHI,基因检测,A,内源性病变基因,正常人,A,病人,正常人(-),病人(+),病原微生物基因,遗传病的诊断,基因缺失、插入或置换等,地中海贫血病,珠蛋白链合成不平衡,A,正常人,病人,正常,病人,PCR-RFLP法：,限制性内切酶,恶性肿瘤（癌基因或抑癌基因）,Ras基因,突变,限制性内切酶,正常,突变,电泳,法医学分析,父父子母,现嫌1嫌2嫌3,（8）SNP技术SNP(SingleNucleotidePolymorphism)，单核苷酸多态性，是指DNA序列中单个核苷酸突变引起的多态性。,（9）RAPD技术RAPD(RandomAmplifiedPolymorphicDNA）称为随机扩增多态性DNA，RAPD是通过利用随机合成的10碱基寡聚核苷酸作为引物,对基因组进行PCR扩增，这些扩增产物DNA片段的多态性,反映了基因组相应区域的DNA多态性。,（10）