微生物生长学习课件

微生物的生长及其控制,第六章,测定微生物生长繁殖的方法微生物的生长规律影响微生物生长的主要环境因素微生物培养法概论有害微生物的控制,第一节测定生长繁殖的方法,1、微生物的纯培养方法,稀释倒平板法,划线法,选择培养基分离法,单细胞挑取法,稀释倒平板法,划线法,Inoculatinganagarplatetoobtainsinglecolonies,选择培养基分离法,2、测定生长繁殖的方法,直接法,间接法,测体积法,生理指标法：含N量法(N6.25=Pr)、DNA/RNA法、叶绿素法、,比浊法：分光光度计（450650nm）测定。,称干量法:离心或过滤后洗涤、干燥、称重。,显微镜直接计数法：,活菌计数法,比例计数法、血球计数板法。,（测总菌数）,（测活菌数）,液体稀释法,菌落计数法,滤膜培养法,快速试纸片法,厌氧菌菌落计数法,平板菌落计数法,测生长量,计繁殖数,各种型号的全自动血球计数仪,血球计数板,2516,1625,第二节微生物的生长规律,一、单细胞微生物的个体生长和同步生长,细胞体积的增大原生质的增加细胞结构的组建,2、研究单细胞微生物个体生长的方法,1、单细胞微生物的个体生长,用电镜观察细胞的超薄切片同步培养(synchronousculture),3、同步生长,诱导法：控制温度、光照、培养基成分等。,（机械筛选法）,选择法：微孔薄膜过滤法、密度梯度离心法等。,获得同步生长的方法：,同步生长通常只能保持12代。,同步生长：P152,(synchronousgrowth),二、单细胞微生物的群体生长规律,生长曲线(growthcurve)：P156。,典型生长曲线,（一）延滞期(lagphase),：P153,1、延滞期特点：P153,（1）生长速率常数为零（2）菌体粗大（3）含量增加,2、延滞期出现原因：P154,当细菌接种到新鲜培养基中培养时，需要合成多种酶、辅酶和某些中间代谢产物，要经过一个调整和适应过程，并不立即进行分裂繁殖，细菌增殖数为0。,3、缩短延滞期的措施,（1）接种对数期菌龄（2）适当增加接种量（10%）,（4）合成代谢活跃（5）对不良条件反应敏感,（3）尽量使用营养丰富的天然培养基，种子培养基与发酵培养基成分尽量一致,（二）指数期(对数期),(exponentialphase),：P154,1、指数期特点：P154,生长速率常数R最大，代时最短，细胞数量呈几何级数增加，活菌数和总菌数接近。,细胞进行平衡生长，群体细胞的化学组成及形态，生理特性比较一致,酶系活跃，代谢旺盛。,t2-t1,3.322(lgx2-lgx1),生长速率常数R=,n=3.322(lgx2lgx1),2、指数期的三个重要参数,（指数期生长的数学模型）,t2-t1,n,=,R,1,3.322（t2-t1）,lgx2-lgx1,G=,=,x2,x1,t2,t1,培养时间,lg细胞数/ml,代时,繁殖代数,菌种,营养成分,营养物浓度,培养温度,4、指数期微生物的应用：P155156,生长限制因子(限制性营养物)：P155,3、影响指数期代时的因素,是代谢、生理研究的良好材料,是噬菌体增殖的最适宿主,是发酵工业用的种子的最佳材料,（三）稳定期(stationaryphase),稳定期：是指微生物活细胞数达到最高并维持相对稳定的时期。,1、稳定期特点：P156,生长速率常数R=0，活菌数保持相对稳定并达最高水平。,细胞内代谢物（内含物）积累达到最高峰。,芽孢杆菌开始形成芽孢。,抗生素等次生代谢产物开始合成。,2、稳定期的重要参数,生长产量常数（生产得率）,X0：接种时的细胞干重（g/ml培养液）,生长产量常数（生产得率，Y）：指菌体产量与营养物质消耗之间出现的有规律的比例关系。,X-X0,C0-C,Y,=,X-X0,C0,Y,=,X：稳定期时的细胞干重(g/ml培养液),C0：限制性营养物最初浓度(g/ml培养液),C：稳定期时限制性营养物的浓度(g/ml培养液),在稳定期时，限制性营养物（限制生长因子）已耗尽，故C=0，因此：,营养物比例失调,3、稳定期出现的原因,：P156,有害代谢产物积累,营养物的消耗,pH值、Eh值等理化条件不适,4、稳定期与生产实践的关系：P156157,是生产菌体或代谢产物的最佳收获时期。,对生长因子进行生物测定的最佳测定时期。,促进了对连续培养的研究。,（四）衰亡期,(declinephase/deathphase),衰亡期：是指由于营养、环境条件等不合适导致活细胞数急剧下降的时期。,1、衰亡期特点：P157,细菌死亡数大于增殖数（R100,极端：,-30,代谢降低,生长繁殖停滞,仍可存活,常在低温下对菌种和食品保藏。,低温对微生物的影响,高温对微生物的影响,细胞内生物大分子(蛋白质、核酸、脂类等)发生不可逆变性或破坏,细胞结构（细胞膜等）发生破坏,常利用高温对物品进行消毒、灭菌,细胞死亡,二、氧气,1、微生物与氧气的关系,2、厌氧菌的氧毒害机制,：SOD学说,微生物生长的pH三基点：,各类微生物能够生长的pH值较宽，但细胞内部pH值却接近中性。,微生物最适生长pH的范围：细菌：多数中性偏碱。放线菌：偏碱。霉菌、酵母菌：多数偏酸。,三、pH,最高生长pH、最适生长pH、最低生长pH。,同种微生物在不同生长阶段或不同生理生化过程中的最适生长pH可能会不同。,固体培养法,液体培养法,好氧菌固体培养法,厌氧菌固体培养,厌氧菌液体培养,1、高层琼脂柱2、厌氧培养皿,4、厌氧罐,5、厌氧手套箱,第四节微生物培养法,一、实验室培养法,3、亨盖特滚管技术,研究厌氧菌最有效的,“三大件”技术,1、用还原性培养基、液面用石蜡油等封盖瓶（管）口密封等液体培养,2、厌氧环境（厌氧罐、厌氧手套箱）中培养,3、台式发酵罐培养,1、试管液体培养2、摇瓶培养,2、平板培养法,1、试管斜面培养,好氧菌液体培养,固体培养法,液体培养法,好氧菌：曲法培养,发酵罐,二、生产实践中的培养微生物装置,厌氧菌：堆积式固态发酵培养法,浅盘培养,厌氧菌培养的“三大件”技术,亨盖特技术中的厌氧试管,厌氧手套箱,厌氧罐,LiquidCulture,Fermentor,好氧菌液体培养,试管液体培养,摇瓶培养,台式发酵罐培养,挂曲,小曲,红曲,近代人工踏制大曲,曲法培养,发酵罐剖面图,发酵罐,第五节有害微生物的控制,消毒：P173。杀死或消除物体上的病原微生物的方法。,灭菌：P173。杀死物体上全部微生物的方法。,防腐：P174。用理化方法防止抑制微生物生长的方法。,一、控制有害微生物的四大措施,化疗：P174。利用对病源菌具有高度毒力而对宿主基本无毒的化学物质来抑制宿主体内病原微生物的生长繁殖。,灭菌、消毒、防腐、化疗的比较：P174表6-8。,二、高温灭菌和消毒,控制微生物的物理因素的代表,1、高温灭菌的原理：高温引起细胞内生物大分子（蛋白质、核酸、脂类等）及细胞结构(细胞膜等)发生不可逆变性或破坏，导致微生物细胞死亡。,3、湿热灭菌比干热灭菌效果好：（1）湿热的穿透力强于干热；（2）湿热下生物大分子更易热变性；（如含水50，蛋白质凝固温度为56；含水时为160-170）（3）水的比热大，降温时水蒸气会放出大量余热。,2、高温杀菌的定量指标：（1）热死时间P176（2）热死温度P176,4、高温灭菌、消毒的种类和方法,种类,处理方法,灭菌/消毒,主要处理对象,煮沸消毒法,LTH法,63维持30min,灭菌,液态风味食品(牛奶、啤酒、果酒、酱油等),常压法,加压法,间歇灭菌法,连消法,巴氏消毒法,HTST法,72维持15s,100数分钟或1530min,80100蒸煮1560分钟，室温过夜。连续三次。,多种。常用121维持1530min。,培养基流经蒸汽管道，经升温、维持(135140515s)、冷却后入罐。,灭菌,灭菌,消毒,消毒,消毒,饮用水:数分钟。食品、器材、衣服等:1530min,牛奶,某些不适于高压灭菌的培养基、食品等,培养基、无菌水、金属器械、玻璃器皿、耐高温食品和材料等,工业生产中的发酵培养基,（优点P176）,湿热灭菌、消毒法,高压蒸汽灭菌法,巴氏消毒法（低温维持法）最初是根据结核杆菌在62下15min被致死而设计的。巴氏消毒法是食品（牛奶）酿造（啤酒）工业中常用的方法。它既可杀死病原微生物、又不致损坏营养，可保留食品饮料原有用味。,目前工业上还有超高温瞬时灭菌法。,巴氏消毒法,巴氏消毒法：概念P175。,影响加压(高压)蒸汽灭菌效果的因素,高温对培养基成分的有害影响及防止,1）灭菌物体的含菌量2）灭菌锅内空气的排除程度3）灭菌对象的pH4）灭菌对象的体积5）加热（上磅）与散热（下磅）速度,P176177,1）有害影响：P1772）防止方法：P178,三、化学杀菌剂（消毒剂和化疗剂）,控制微生物的化学因素,评价化学药剂制菌、杀菌效果的定量指标：,最低抑制浓度（MIC）：P178,半致死剂量（LD50）：P178,最低致死剂量（MLD）：P178,（一）表面消毒剂(surfacedisinfactant),1、表面消毒剂对微生物的作用：,极低浓度：刺激生长,低浓度：制菌,较高浓度：杀菌,2、评价表面消毒剂相对杀菌强度的比较标准石炭酸系数（P.C.）P179,3、不同表面消毒剂的作用机制、使用浓度、应用范围：P179表6-10,70%75%乙醇的消毒效果比无水乙醇好。,（二）化学治疗剂,化学治疗剂：是指能直接干扰病原微生物的生长繁殖，并可用于治疗传染性疾病的化学药物。,抗代谢物,抗生素,生物药物素等,化学治疗剂,1、抗代谢物(antimetabolite),与生物体内所必需的代谢物结构相似、可以和特定的酶结合从而阻碍酶的功能、干扰代谢活动的正常进行的化学物质。,抗代谢物具有“选择毒力”作用。,（1）抗代谢物：P180,二氢蝶啶,二氢蝶酸,二氢叶酸,四氢叶酸,核酸、氨基酸等,前体,PABA,Glu,TMP,TMP:三甲基苄二氨嘧啶，抗代谢物，磺胺增效剂,（2）磺胺药的制菌机制,二氢蝶酸合成酶,：磺胺类药物，抗代谢物。磺胺：R=-H,：PABA，对氨基苯甲酸，正常代谢物,FH2合成酶,（FH2）,FH2还原酶,2H,THFA或FH4,THFA作为一碳单位转移酶的辅酶参与代谢,磺胺,2）细菌利用PABA合成THFA的代谢反应及磺胺的阻断部位：,1）代谢物及抗代谢物：,3）抗菌机制,2009.5.31.,2、抗生素(antibiotic),（1）抗生素：是一类低浓度下就能抑制或干扰其他微生物（或其他生物）生长并可作为化学治疗剂的微生物次生代谢产物及其人工合成衍生物。,（2）抗生素产生菌：,抗生素主要由微生物（大多数为放线菌）产生，但目前在其他生物中也偶尔发现。,产抗生素最重要的微生物,链霉菌属（放线菌）,芽孢杆菌属（细菌）,青霉属（霉菌）,头孢霉菌属（霉菌）,（3）部分常见的抗生素及其作用机制,（4）抗生素的效价,抗生素的效价：指抗生素的活力，即一定试样中所含抗生素的单位数（U）。,规定：各种抗生素的1mg游离碱为1000U，即：1000U/mg,抗生素盐类的效价可根据相对分子质量折算。如：青霉素G的钠盐纯品的效价为1667U/mg,抗生素效价测定的常用方法：管碟法。,（5）抗菌谱,：抗生素的抗菌作用范围。,抗生素具有“选择毒力”作用。,抗生素,狭谱抗生素：如青霉素主要抗G+细菌。,广谱抗生素：如四环素能抗G-细菌、立克次氏体、衣原体和某些G+细菌。,病毒无细胞结构，缺乏抗生素干扰的相应机制，故目前尚无病毒的特效抗生素。,（6）半合成抗生素：P184。如氨苄青霉素。,（7）微生物产生抗药性的原因：P185。,3、生物药物素：具有多种生理活性的比抗生素疗效更为