临床检验常用实验技术简介.pptx

临床检验常用实验技术简介,刘春芳博士复旦大学附属华山医院检验医学科,光谱分析技术,电化学分析技术,电泳-色谱分析技术,荧光-化学发光技术,分子生物学技术,抗原抗体反应实验技术,光谱分析技术,利用各种化学物质所具有的发射、吸收或散射光谱谱系的特征，来确定其性质、结构或含量的技术。,吸收光谱分析（可见-紫外吸收光谱分光光度法，原子吸收分光光度法）,发射光谱分析（荧光分析法和火焰光度法）,散射光谱分析（比浊法）,肝功能、肾功能、血糖、血脂,吸收光谱：是指物质吸收光子，从低能级跃迁到高能级而产生的光谱。不同物质对不同波长光的吸收具有选择性。,朗伯比尔定律（Lambert-Beer定律）：当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的吸光物质时,其吸光度A与吸光物质的浓度C及吸收层厚度B成正比。,AKBCA-吸光度（Absorbance）K-吸光系数B-透光液层厚度C-溶液浓度（实用范围：均匀、非散射介质）,直接吸收峰：如蛋白280nm,核酸260nm吸收峰,染料结合：,溴甲酚绿-白蛋白测定,黄变蓝绿色,双缩脲法-总蛋白,蓝紫色,丽春红染色,考马斯亮蓝染色,TrinderReaction,1969年,工具酶,葡萄糖、尿酸、甘油、胆固醇的测定,1.偶联H202的工具酶及指示反应,2.NAD(P)+或NAD(P)H偶联的脱氢酶及指示反应,NADH和NADPH在340nm有特征性吸收峰,多种酶活性测定,H,固定时间法（两点法、终点法）,连续监测法（动态监测）,待测物吸光度标准液浓度样品浓度标准液吸光度,1.与标准品直接比较,2.标准曲线法,荧光分析法,物质的分子、原子或离子在辐射能的作用下，使其由低能态或基态跃迁到高能态（激发态，激发光谱），由高能态回到较低能态或基态而产生的光谱称为发射光谱。,荧光强度：荧光强度与该种物质的荧光量子产率、消光系数以及含量等因素有关。,荧光光谱的波长通常比激发光的波长。,光束通过容易浑浊颗粒（不均匀媒质）后的光散射程度，常用法为比浊法。,散射光谱,检测器,主要用于抗原或抗体的定量,当一束光线透过胶体，从入射光的垂直方向可以观察到胶体里出现的一条光亮的“通路”，这种现象叫丁达尔现象。,电化学发光（ECL）分析法,是电场参与化学发光所产生的结果，是指通过施加一定的电压进行电化学反应。,化学发光,物质在进行化学反应过程中伴随的一种光辐射现象。,反应中间体或产物吸收了反应释放的化学能，而处于电子激发状态，当回到基态时释放的能量。,电化学分析技术,利用物质的电化学性质，测定化学电池的电位、电流或电量的变化进行分析的方法称为电化学分析法。,选择性电极,参比电极,主要用于检测电解质、血气分析、PH检测等,PH电极、PCO2电极、PO2电极、离子选择电极,主要组成部分：电极和测量室、恒温装置、管路系统、电子控制系统、显示屏和打印装置。,利用电极电位和离子活度的关系来测定离子活度的一种电化学技术，其核心是采用对被测离子选择性响应的敏感膜。,Na+硅酸锂；K+缬氨霉素；Cl-AgCl,PH电极,色谱法（chromatography）又称“色谱分析”、“层析法”，是利用物质的物理化学性质的差异，而测定物质的一种分离和分析方法。,色谱分析技术,包括色谱技术、电泳技术,固定相、流动相,醋酸纤维薄膜电泳、凝胶电泳、等电聚焦电泳、毛细管电泳等。,色谱技术：,当待分离的混合物随着流动相通过固定相时，由于各组分的理化性质存在差异与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相发生中的分配（含量比）不同，且随流动相向前移动，各组份不停地在两相中进行再分配，从而达到各组分分离的目的。,固定相不同分为：凝胶、离子交换、亲和色谱等。,用于：激素、维生素、血红蛋白、胆汁酸等的测定。,检测器：紫外可见分光光度、质谱,流动相不同分为：气相色谱法，液相色谱法,HPLC检测糖化血红蛋白,在直流电场中，带电离子向带符号相反的电极移动的现象称为电泳。,电泳技术（ElectrophoresisAnalysis）,醋酸纤维薄膜电泳、凝胶电泳、等电聚焦电泳、毛细管电泳等。,在碱性环境中（pH8.6）血清蛋白带负电，在进行电泳时，血清中不同的蛋白因电荷/质量比不同，导致泳动速度差异而得以分离。,目前主要是血清蛋白分析、PCR产物分离等。,抗原抗体反应,抗原与抗体的特异性结合是基于抗原决定族（表位）和抗体超变区分子间的结构互补性和亲和性。,分为：抗原抗体发生特异性结合阶段和可见反应阶段（出现凝集、沉淀、补体结合介导的肉眼可见的反应）。,非共价键结合,静电引力，范德华力，氢键结合力、疏水作用,红细胞凝集、比浊法,具有特异性、可逆性、比例性,临床免疫检验常用的分析技术,分类：免疫标记技术沉淀反应-抗原抗体浓度检测，抗原或抗体分离等。凝集反应-血型分析溶血反应-补体测定等免疫比浊法-多种抗原抗体检测、肿瘤标志物检测、微量蛋白等,免疫标记技术,定义：将抗原/抗体用可以微量检测的标记物（如荧光素、酶、同位素、金颗粒、发光物质等）进行标记，则在与标本中的相应抗体或抗原反应后，可以不必测定抗原抗体复合物本身，而测定复合物中的标记物，通过标记物的放大作用，进一步提高免疫技术的敏感性。,一.(1)免疫组化技术（immunohistochemicaltechnique）(2)免疫测定（immunoassay）:用于液体标本中抗原或抗体的测定.二.(1)免疫荧光技术(2)酶免疫技术(3)放射免疫技术125I-甲状腺激素(4)金标技术（胶体金）-早孕试纸条(5)化学发光技术,免疫荧光,抗核抗体,组织学和免疫学技术的结合,检测组织、细胞、微生物,免疫标记技术酶免疫技术,分类:酶免疫组化技术酶免疫技术均相（homogenous）酶免疫测定技术异相（heterogenous）酶免疫测定分类根据:抗原抗体反应后是否需要分离结合与游离酶标记物,分离技术,抗原-抗体复合物的分离：固相载体（酶联免疫吸附实验，ELISA）,免疫磁珠（电化学发光）,酶、发光物质,酶免疫技术固相酶免疫技术酶联免疫吸附测定（Enzymelinkedimmunosorbentassay-ELISA）,双抗体夹心法原理（操作步骤）：(1)特异性抗体包被载体形成固相抗体.(2)洗去未结合的抗体和杂质.(3)加入待测样品，使其中相应抗原和固相抗体呈特异性结合成复合物.(4)再洗涤除去未结合的物质.(5)加酶标抗体，使之与固相上的抗原呈特异性结合.(6)经充分洗涤后除去未结合的游离酶标记抗体.(7)加入相应酶的底物，固相化的酶催化底物变成有色产物，颜色反应的程度与固相上抗原的量有关.适用范围：检测抗原的最常用方法,用此方法检测的抗原，应至少有2个以上结合位点，故不能用以测定半抗原物质,夹心法,酶免疫技术固相酶免疫技术酶联免疫吸附测定（Enzymelinkedimmunosorbentassay-ELISA）,竞争法：,ELISA方法检测戊型肝炎病毒（HEV）抗体程序,HEVIgM/IgGELISAKit,酶标板,说明书:+/-对照有潜在传染性,洗板液(20X)稀释液终止液底物液酶结合液+/-对照,试剂盒,IgM,IgG,1.包被(重组HEVAg),2.加稀释液（200l孔),4.盖板,3.加样,5.洗板,显色,电化学发光（ECL）分析法,是电场参与化学发光所产生的结果，是指通过施加一定的电压进行电化学反应。,具有强氧化性的三价的三联吡啶钌Ru(bpy)33+和具有强还原性的三丙胺自由基TPA发生氧化还原反应，结果使三价的三联吡啶钌Ru(bpy)33+还原成激发态的二价的三联吡啶钌Ru(bpy)32+，激发态Ru(bpy)32+衰变并以释放出波长为620nm光子的方式释放能量，而成为基态的Ru(bpy)32+。,体系中电极表面的三丙胺TPA释放电子，进而释放质子成为自由基TPA，同时，二价的三联吡啶钌Ru(bpy)32+释放电子成为三价的三联吡啶钌Ru(bpy)33+。,电化学发光独特的磁性微粒子,其特点是表面积极大(直径2.8微米)，吸附效率高；在液体中形成均匀的悬液，参与反应时类似液相，反应速度快。由于带有磁性，在游离标记物与结合标记物分离时，只需用磁铁吸引，方便迅速。,链霉亲和素（streptoavidin，SA）和生物素（biotin，B）是具有很强的非共价相互作用的一对化合物。,1.试剂/样本加入反应杯第一抗体标记生物素（与微磁珠结合）第二抗体标记钌Ruthenium（产生光信号）,双抗体夹心法为例,2.两种抗体皆能与靶抗原特异性结合，生成抗原抗体复合物,3.加入链霉亲和素包被的磁珠,4.最终在反应杯里形成磁颗粒连接的抗原抗体复合物,5.反应杯中的复合物被转移至测量池,测量池中启动磁场，吸附磁颗粒连接的免疫复合物。加入Procell溶液，去除反应体系杂质并提供三丙胺TPA。,6.在测量池电场环境下TPA提供电子，激发钌发出光信号,Ru(bpy)32+,7.测量池中的工作电极采集光信号,免疫标记技术电化学发光检测技术(ElectroChemiLuminescence,ECL),ROCHECOBASE601,分子生物学诊断技术,分类：（1）核酸分子杂交技术(molecularhybridization)固相、液相杂交（2）体外基因扩增技术聚合酶链反应（polymerasechainreation,PCR）连接酶链反应（ligasechainreaction,LCR）（3）DNA序列分析技术（DNAsequencing）化学降解法(chemicalcleavagemethod)末端终止法(chainterminationmethod)（4）基因突变分析技术RFLP、SSCP、ASO、DGGE、SNP（5）基因功能研究技术基因克隆（genecloning)基因转导(genetransducting)反义(antisense)基因剔除(geneknockout)和转基因人工染色体的转导(artificalchromosometransducting)RNA干涉(RNAinterference),荧光原位杂交(Fluorescenceinsituhybridization,FISH),Double-StrandedDNA,HBcAg,DaneParticle,DNAPolymerase,HBeAg,HBsAg,是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术。,聚合酶链式反应(PCR),PCR原理PCR仪,变性、退火、延申,实时荧光定量PCRQuantitativeReal-timePCR,是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。SYBR荧光染料，TaqMan探针法。,应用项目：HBVDNA，HCVRNA,PCR扩增后，发射荧光信号，未扩增不会发射任何荧光信号,生物芯片技术(biochip),又称微阵列（microarray)采用原位合成（insitusynthesis）或显微打印手段，将数以万计的探针固化于支持物表面上，产生二维探针阵列基因芯片（DNAchipmicroarray)蛋白芯片SELDI/MALDI,高通量测序技术,5/7/2020,48,思考题,1.Trinder法（氧化酶法）和己糖激酶法测定血清葡萄糖的原理和方案?2.ELISA检测技术的双抗体夹心法、竞争法的原理和适用范围?,3