临床免疫学检查乙肝两对半检查实验.ppt

临床免疫学检查,（乙肝两对半检测）叶松道,【实验内容】ELISA法检测乙型肝炎病毒标志物：1.乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）2.乙型肝炎病毒表面抗体（抗HBs、HBsAb）3.乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）4.乙型肝炎病毒e抗体（抗HBe、HBeAb）5.乙型肝炎病毒核心抗体（抗HBc、HBcAb）,【实验原理】,酶联免疫吸附试验（ELISA）一种固相酶免疫测定技术：先将抗体或抗原包被到某种固相载体表面，与待测样品中的抗原或抗体发生反应，再加入酶标抗体或抗原与免疫复合物结合，最后加入酶反应底物，根据底物被酶催化产生的颜色及其吸光度（A）值的大小进行定性或定量分析。,ELISA检测类型,双抗体夹心法双位点一步法HBsAgHBeAg间接法HBsAb竞争法HBeAb、HBcAb捕获法,双抗体夹心法检测示意图,孵育30min后，充分洗板,双位点一步法检测示意图,抗原过多，可能出现后带现象，假阴性,间接法检测示意图,竞争法检测示意图,如何读取结果？,乙型肝炎病毒诊断试剂盒组成,微孔反应板4孔酶结合物1瓶阳性对照1瓶阴性对照1瓶显色剂A1瓶显色剂B1瓶,洗涤液1大瓶,操作步骤,1.加样：标本50ul空白对照阴性对照1滴四个酶标孔内阳性对照1滴注：HBcAb-待测标本用生理盐水作130稀释（50ul标本+1.5ml生理盐水）2.加酶结合物：除空白对照孔外，每孔加入酶结合物1滴，充分混匀，置37孵育30分钟。,操作步骤,3.洗板：弃去孔内液体，洗涤液注满各孔，静置5秒，甩干，重复5次后拍干。4.显色：每孔加显色剂A液、B液各1滴，充分混匀，置37孵育10分钟。5.结果观察：有无显色反应。,结果判读,显色反应呈蓝色肉眼判读：HBsAgHBsAbHBeAg蓝色为阳性，无色为阴性。HBeAb和HBcAb测定时，由于采用竞争法，所以判断结果时刚好相反，无色为阳性，蓝色为阴性。,结果报告,HBsAg:阴性（阳性）HBsAb:阴性（阳性）HBeAg:阴性（阳性）HBeAb:阴性（阳性）HBcAb:阴性（阳性）,注意事项,HBcAb测定：待测标本稀释后的检测结果为临床意义；不作稀释的检测结果为流行病学意义。竞争法判断结果时要注意。冷藏环境中取出的试剂盒及标本使用前应置室温平衡30分钟后才可测定。使用前试剂应摇匀，并弃去1滴后垂直滴加。结果判断需在反应终止后10分钟内完成。,我国HBV感染概况,一般人群HBsAg携带率高达7.18%；现有慢性HBV感染者约9300万人，占全世界的1/4；其中慢性乙型病毒性肝炎患者超过2000万例，占全世界慢性乙肝患者的1/3；15岁以下儿童HBsAg携带率下降显著，1-4岁组仅为0.96%；14岁组HBsAb阳性率由1992年15.75%升至72.25%;抗HBcAb阳性率由1992年30.08%降至3.76%,15,乙型肝炎病毒病毒标志物检测,乙型肝炎表面抗原（HBsAg）乙肝病毒前S1抗原抗乙肝病毒前S1抗体乙肝病毒前S2抗原抗乙肝病毒前S2抗体乙型肝炎核心抗原（HBcAg）,乙肝核心抗体（抗-HBc）乙型肝炎表面抗体（抗-HBs）乙型肝炎e抗原（HBeAg）乙型肝炎e抗体（抗-HBe）乙型肝炎病毒DNA,1）最常用的检测项目两对半测定方法：ELISA、放射免疫法（RIA）、发光免疫法(定量)2）乙肝DNA定量PCR检测病毒复制、诊断依据、传染性、疗效监测等,乙型肝炎病毒病毒标志物检测,乙肝两对半,HBsAg（表面抗原）：存在于Dane颗粒的表面的糖蛋白。判断HBV感染的指标之一，阳性见于急性乙肝的潜伏期，发病时达高峰，如果发病后3个月不转阴，则易发展成慢性乙型肝炎。抗-HBs（表面抗体）：是一种保护性抗体，可阻止HBV穿过细胞膜进入新的肝细胞，提示机体对乙肝病毒有一定程度的免疫力。是机体感染或接种乙肝疫苗的标志。HBeAg（e抗原）：其阳性是乙型肝炎的重要标志，提示病毒活动性较强，传染性较大。持续阳性，表明肝细胞损害较重。抗-HBe（e抗体）：抗-HBe的出现意味着大部分HBV被消除，复制减少，传染性降低，但并非无感染。抗-HBc（核心抗体）：反映肝细胞受到HBV侵害的一种指标，阳性表示正在感染或既往感染。,HBcAg(核心抗原)：是乙肝病毒存在的直接