微生物的生长和控制1

第七章：微生物的生长和控制,第一节：微生物的生长,教学目标,掌握微生物生长曲线环境因子对生长的影响了解生长的测量方法连续培养自然环境中的生长,一、生长曲线,微生物的生长与繁殖,微生物生长(Growth)：是指细胞物质有规律地、不可逆增加的生物过程。微生物繁殖(Reproduction)：是微生物生长到一定阶段由于细胞内各种细胞结构的复杂和重建导致产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的整个生物学过程。群体生长=个体生长+个体繁殖,微生物生长曲线(GrowthCurve),延滞期(LagPhase),表现细胞数目不增加或增加很少原因Old,depletedofATP,ribosomsMediumEnzymesRecover长度菌种(Inoculum)培养基,对数期(LogPhase),表现Maximalrate特点Constantincrease,时间,细胞对数,细胞对数,时间,BalancedGrowth营养与细胞最终产量,TheMonodRelationship,细胞数或菌体量,限制性营养物浓度,增加,稳定期(StationaryPhase),表现生长速率锐减到0，细胞数目相对不变。109106分裂/死亡不分裂原因营养耗尽有毒代谢物积累,Starvation表现：shrinkagePositiveeffects,Starvationproteins,加固肽聚糖,保护DNA(Dps),分子伴侣(Chaperons)保护各种蛋白质,衰亡期(DeathPhase),平衡打破，群体死亡占优势特点Logarithmic对数性细胞总数不变死亡速率最后会逐渐减小,生长的机制,设：N0：起始细胞数目Nt：某时间(t)细胞数目n：在时间t内繁殖的代数则：Nt=N02n若求n，两边以10为底取对数：Log10Nt=Log10N0+Log102n,LogNt=LogN0+nLog2n=(LogNt-LogN0)/Log2=(LogNt-LogN0)/0.301设：R：平均生长速率(相对速率、比速度)G：平均代时则：R=n/t=(LogNt-LogN0)/0.301t当分裂一代时：Nt=2N0t=G,R=(LogNt-LogN0)/0.301t=Log(2N0)-LogN0/0.301G=(Log2+LogN0-LogN0)/0.301G=1/G例如：103109in10hoursR=(Log109-Log103)/0.30110hr=93/3.01hr=2.0generations/hr,G=1/R=1/(2.0gen/hr)=0.5hr/gen=30min/gen代时的可变性,几种微生物的代时,二、生长的测量方法,细胞数目的测定,血球计数板(Hemocytometer)Petroff-HausserCountingChamber,0.02mm深1mm2面积25方格,细菌数目/ml=每方格细菌平均数2550103,若每方格细菌平均数为28，则菌悬液样品的细菌密度是:3.5107个细菌/ml。,蚀刻部分放大,缺点：浓度要足够大，且耗时不能分辨死活细胞电子细胞计数器如CoulterCounter应用于较大单细胞微生物的计数，也广泛应用于血细胞计数。,自动平板菌落计数器,工作原理：利用细胞经过小孔时引起的电阻变化计数。缺点：不能进行细菌计数平板菌落计数法(PlatingTechniques)活细胞计数的方法,例如：1.0ml10-6稀释液平均长出150个菌落(Colonies)，则原始菌悬液浓度约为：1.5108cells/ml缺点：细胞分散问题CFU,ColonyFormingUnitsMedium浓度要求,虑膜计数(MembraneFilterCounting),Standardmedium,Fecalcoliformmedium,M-endoagarmedium,Wortagarmedium,虑膜直接计数法：应用荧光染料(如吖啶橙、DAPI、TrypanBlue等)、特殊黑色聚碳酸酯虑膜和荧光显微镜(如EpiflourescenceMicroscope,落射式荧光显微镜)直接计数。一般较平板法计数多。,Micrococcus&Bacills活细胞绿色死细胞红色,细胞量测定,离心烘干检测细胞中某元素或某物质比浊法微生物培养液对光线的散射浊度(Turbidity)和分光光度计(Spectrophotometer),三、连续培养,概念：以恒定流速使营养物质浓度恒定而保持细菌生长速率恒定的方法。原理：通过控制某一种营养物浓度（如碳、氮源、生长因子等），使其始终成为生长限制因子，而达到控制培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率条件下进行生长繁殖。特点：维持营养成分的亚适量，控制微生物生长速率。菌体生长速率恒定，菌体均一、密度稳定，产量低于最高菌体产量。应用范围：实验室科学研究,恒化器(TheChemostat),稀释率(DilutionRate,D)表征培养基更新速度的物理量，与两个因素相关：培养器容积V，培养基流速f。D=f/V例如：f=30ml/hrV=100ml则该培养系统稀释率为：D=0.30hr-1,Biomass-limitednutrient-D,概念：通过调节培养基流速，使培养液浊度保持恒定的连续培养方法。原理：通过调节新鲜培养基流入的速度和培养物流出的速度来维持菌浓度不变,即浊度不变。主要采用恒浊器，当浊度高时，使新鲜培养基的流速加快，浊度降低，则减慢培养基的流速。特点：基质过量，微生物始终以最高速率进行生长，并可在允许范围内控制不同的菌体密度；但工艺复杂，烦琐。,使用范围：用于生产大量菌体、生产与菌体生长相平行的某些代谢产物，如乳酸、乙醇等。,恒浊器(TheTurbidostat),恒浊器与恒化器的比较,四、环境因子对生长的影响,水活度和盐浓度,Extremophiles(嗜极菌)渗透压(OsmoticConcentration)的作用微生物对渗透压的反应.低渗：压力敏感通道(PressureSensitiveChannels)内含物(InclusionBodies)高渗：相容性溶质(CompatibleSolutes)：胆碱(Choline)、甜菜碱(Betaine)、脯氨酸(Proline)、,谷氨酸(Glutamicacid)其它氨基酸及钾离子。SucrosePolyols蔗糖和糖醇类：Arabitol阿拉伯糖醇Glycerol甘油Mannitol甘露醇PotassiumionsandSodiumions（钾离子和钠离子）ContractileVacuoles（伸缩泡）,大多数原核生物,真菌和藻类,Halobacterium,原生动物,水活度（WaterActivity）可用水的损失：theOsmoticeffectandtheMatriceffectaw=P(溶液)/P(纯水)=1/100relativehumidity（相对湿度）,95相对湿度,0.95水活度,1.00,血液蔬菜水果、肉类,大多数G-细菌,0.95,面包、海水,大多数G+杆菌,大多数球菌芽孢杆菌类,担子菌类,大多数藻类,0.90,火腿,子囊菌酵母毛霉、根霉,0.85,腊肠,葡萄球菌,鲁氏酵母,0.80,蜜饯,青霉,0.75,盐湖腌制鱼类,盐杆菌类,曲霉,杜氏藻,0.70,曲霉,0.60,谷类、糖果干制水果,巧克力、蜂蜜、奶粉,0.55,DNA失活,水活度,环境,细菌,真菌,藻类,耐干霉菌,Halophiles（嗜盐菌）NaCl约26MHalobaterium盐杆菌机制：改变蛋白质结构积累钾离子（47M）细胞壁、膜结构需高钠稳定,pH,pH的概念不同pH环境下的微生物,Acidophiles,嗜酸菌,Neutrophiles,嗜中性菌,Alkalophiles,嗜碱菌,15.5,5.58.5,8.511.5,多数细菌、原生动物,芽孢杆菌,多数真菌、藻类,微生物对pH要求的特点总体范围广，个体差异大。每种微生物都有其pH生长三基点。微生物生长的最适pH是相对的。,微生物在允许pH范围内的调节微生物细胞内的pH一般接近中性。质膜不透质子。K+/H+Na+/H+antiportsystem（反向运输系统）解决小范围pH变动。,内部缓冲液(InternalBuffer)的作用。较大pH变动时ProtonTranslocatingATPase(质子移位ATP酶)发挥作用。（如对E.coli降至5.56.0时）pH更大变动(forE.coli4.5)，Chaperons开始合成。如AcidShockProteinsandHeatShockProteins。pH过大变动对微生物的损害主要是影响膜和膜上的转运蛋白，也通过影响营养物的解离间接影响微生物。微生物活动对环境pH的反作用,温度,与pH的影响十分相似，其机理主要在于酶的活力、蛋白质和核酸的稳定性、膜的结构和功能等。低温一般是只影响功能，不影响结构。很多菌种有很大开发潜力。,嗜冷菌,耐冷菌,嗜温菌,嗜热菌,极端嗜热菌,氧气,过氧化氢酶,专性好氧菌,兼性好氧菌,耐氧菌,严格厌氧菌,微好氧菌,专性好氧菌（strict/obligateaerobe）,必须在有分子氧的条件下才能生长，有完整的呼吸链，以分子氧作为最终氢受体，细胞含有超氧物歧化酶（SOD，superoxidedismutase）和过氧化氢酶。,在有氧或无氧条件下均能生长，但有氧情况下生长得更好，在有氧时靠呼吸产能，无氧时接发酵或无氧呼吸产能；细胞含有SOD和过氧化氢酶。,微好氧菌（microaerophilicbacteria）,只能较低的氧分压下才能正常生长，通过呼吸链并以氧为最终氢受体而产能，,兼性好氧菌（facultativeaerobe）,耐氧菌（aerotolerantanaerobe）,可在分子氧存在下进行厌氧生活的厌氧菌。生活不需要氧，分子氧也对它无毒害。不具有呼吸链，依靠专性发酵获得能量。细胞内存在SOD和过氧化物酶，但缺乏过氧化氢酶。,厌氧菌（anaerobe）,分子氧对它有毒害，短期接触空气，也会抑制其生长甚至致死；在空气或含有10%CO2的空气中，在固体培养基表面上不能生长，只有在其深层的无氧或低氧化还原电势的环境下才能生长；生命活动所需能量通过发酵、无氧呼吸、循环光合磷酸化或甲烷发酵提供；细胞内缺乏SOD和细胞色素氧化酶，大多数还缺乏过氧化氢酶。,严格厌氧微生物并不是被气态的氧所杀死，而是由于不能解除某些氧代谢产物的毒性而死亡。（以及酶的影响）在氧还原为水的过程中，可形成某些有毒的中间产物，例如，过氧化氢（H2O2）、超氧阴离子（O2）等。超氧阴离子为活性氧，兼有分子和离子的性质，反应力极强，极不稳定，可破坏膜和重要生物大分子，对微生物造成毒害或致死。好氧微生物具有降解这些产物的酶，如过氧化氢酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶等，而严格厌氧菌缺乏SOD，故易被生物体内极易产生的超氧阴离子自由基毒害致死。,厌氧菌的氧毒害机制SOD学说：,各类菌所含对氧解毒酶,专性好氧菌SOD，过氧化氢酶兼性厌氧菌SOD，过氧化氢酶专性厌氧菌二种酶均无微好氧菌SOD和少量过氧化氢酶耐氧菌SOD，过氧化物酶,H2O+O22O2+2H+O2+H2O22H2O,O2+eO2(O2),生物体中超氧阴离子的形成与去除,12,SOD好氧生物和耐氧细菌,过氧化氢酶好氧生物,过氧化物酶NADH2NAD耐氧菌,氧气与微生物的培养培养好氧微生物：需震荡或通气，保证充足的氧气。培养兼性厌氧或耐氧微生物：可深层静止培养。培养专性厌氧微生物：在培养的各个环节驱除氧气.培养基加入还原性物质（如铁屑、巯基乙酸、半胱氨酸等），还可加入Eh指示剂（如刃天青）。培养器皿采用特殊的培养皿，如Brewer培养皿和Bray培养皿培养基的配置过程煮沸法驱除其中氧气。亨盖特滚管技术(Hungateroll-tubetechnique),（Eh）,培养环境,中小培养量：theGasPakjar,大培养量：theAnaerobicWorkChamberandIncubator,压力,在深海中存在这对压力有耐受力的微生物或嗜压微生物。,辐射,辐射的基本知识辐射的损害,电离辐射X-rays射线损害途径很多，主要是在O2的参与下形成氢氧根自由基（OH）；对DNA的损害是最致命的。紫外线（10400nm）最致命的波长为260nm，可使DNA形成嘧啶二聚体。能被多种修复机制修复。到达地面的阳光近紫外区（300400nm）对微生物也是有害的，但是机制同以上不同，与色氨酸有关。,可见光的损害光敏感色素吸收光能产生单键氧(SingletOxygen)。,类胡萝卜素被大多数微生物用来避免这种可见光损害。,五、自然环境中的微生物,微生物在自然环境中生长的规律：Liebigslawoftheminimum&Shelfordlawoftolerance.ViableButNonculturableBacteriaQuorumSensing细菌之间的“群体效应”。,酰基高丝氨酸内酯A-HSLs,本节结束,log10Nt,Log102=0.301,Log104=0.602,Log108=0.903,Log1016=1.204,Log10