薄层色谱和柱层析ppt课件

2020/5/8,.,薄层色谱(TLC),1概述色谱法是目前最常用的一类分离技术，它利用不同结构或不同性质的物质在不相混溶的两相中分布不同而进行分离。当将其中一相固定（称固定相），而使另一相流过（称流动相）时，则这些物质被流动相带动，以不同的速度向前移动，经过一段时间后，不同的物质移动的距离有较明显的差异，从而达到分离。该方法目前已有多种操作，由于分离效能好，操作简便，已在各个领域中得到广泛的应用。关于色谱法的发展可追溯到十九世纪末、二十世纪初的俄国，最先由植物学家研究色素时发现。但直到二十世纪三、四十年代才开始实际应用。1941年，A.J.P.Martin和R.L.M.Synge为解决氨基酸的分析问题，,2020/5/8,.,将溶剂抽提中的一个相固定在硅胶上，装在柱内，并按色谱法操作，使另一液相流过柱子，分离获得成功。从此出现了基于分配原理的分配色谱法，因此获得了诺贝尔奖。以后的发展采用了纤维素、继而采用滤纸作分配色谱载体，发展了纸色谱法。薄层色谱法的研究和发展也出现在二十世纪的三、四十年代，现在已和气、液色谱一起成为最常用的色谱分离、分析方法。为与柱色谱相区别，并突出纸色谱和薄层色谱的特点，这两种方法也叫平床色谱法（Flatbedchromatography）或平面色谱法（Planarchromatography）。色谱法经过多年的发展已有多种操作形式，其分类方法也有多种。按固定相和流动相的物态可分为以气体为流动相的气相色谱（包括气固色谱、气液色谱）和以液体为流动相的液相色谱（包括液固色谱、液-液色谱）；如以固定相的操作方式以及形状分类则有柱色谱、纸色谱、薄层色谱；,2020/5/8,.,2-薄层色谱中，组分的移动情况常用比移值Rf来表示：Rf=原点至组分点中心的距离/原点至流动相前沿的距离也有用“高比移值”表示：hRf=Rf100和“相对比移值”表示，即相对于某一物质X的Rf值，用Rx表示：Rx=Rf/Rx（原点至组分点中心距离与原点至物质X点中心的距离的比值）Rf总小于1；Rx可小于1，也可大于1；hRf可在1100之间,2020/5/8,.,薄层色谱中，Rf值与组分的分配系数K值有关：K=Cs/CM=溶质在固定相中浓度/溶质在流动相中浓度若该组分的移动距离为d1，流动相移动距离为dm,d2=dmd1Rf=d1/dm=d1/(d1+d2)如果组分的分配系数大，则在水中分配量大，移动距离小，Rf小。因此，K与d1、d2有如下关系：Kd2/d1此外，移动距离也与二相之体积比有关，体积大者，在其中分配的量也多。如以Vs表示固定相的体积，Vm表示流动相的体积Vs/Vmd2/d1,2020/5/8,.,合并上两式：d2/d1=KVs/VmRf=d1/(d1+d2)=d1/(d1+d1KVs/Vm)=Vm/(Vm+KVs)或K=Vm/Vs(1/Rf1)若实验条件固定，则两相体积比也固定不变，则决定Rf的主要因素是分配系数K。由K值可推倒出Rf值。但有时纸纤维对某些物质也有作用，从而使实测Rf值与计算（推倒）Rf值有一定差别。在分配色谱中，但固定液的极性大于流动相的极性时，称为正相分配；当固定液的极性小于流动相的极性时称为反相分配。通常纸色谱均为正相，即有机溶剂为流动相，吸收在滤纸上的水分作固定相。但有时也有将滤纸用极性较小的液体（如烃类）处理后作固定相，而以极性较大的含水溶剂作流动相，则为反相色谱。用DMF处理的仍然为正相。,2020/5/8,.,薄层色谱与HPLC的对比薄层色谱HPLC色谱系统开放式闭路展开方式展开洗脱流速控制吸附剂的毛细管作用由泵调节平衡时间短不定分析样品可同时分析多个每次一个样品样品量高低板高（m）3025有效板数6005000检测方式静态动态溶剂用量少多溶剂更换易难固定相一次弃去重复使用,2020/5/8,.,4-吸附剂与载体（1）对吸附剂的要求（）具有大的表面积与足够的吸附能力（）对不同组分有不同吸附性能，这样有好的分离效果（）在所用溶剂和展开剂中不溶解（）不与试样中各组分、溶剂和展开剂起化学反应、破坏或分解作用,2020/5/8,.,（）粒度均匀，使用过程中不破坏（）具有可逆的吸附性，既能吸附样品组分，又易于解析（）为便于观察分离结果，吸附剂最好为白色。常用的吸附剂有硅胶、氧化铝、聚酰胺、硅酸镁、而CaO、MgO、Ca(OH)2、Mg(OH)2、CaSO4、Ca3(PO4)2、Mg3(PO4)2、淀粉、蔗糖等，或因碱性太大，或吸附性太弱，用途有限，活性炭因吸附性太强和黑色，使应用受到限制。（2）分配色谱对载体的要求（）表面积大（）在展开剂中不溶，与展开剂和样品组分不起化学反应或分解作用（）对样品组分无吸附性或吸附性弱（）对固定液是惰性的,2020/5/8,.,常用的有纤维素和硅藻土。实际工作中，吸附剂、载体等的选择，首先决定于样品成分的性质，即它们的溶解度、酸碱性、极性以及是否与吸附剂起化学反应等，还有价格、是否容易得到等。（）样品的溶解度任何类型的化合物都可首先考虑使用硅胶和氧化铝薄层，如果水溶性的化合物在吸附薄层上分离不好，可试用纤维素或硅藻土分配薄层，如果正相不行可选用反相。（）样品的酸碱性硅胶略带酸性，适用于酸性和中性物质分离；碱性物质与硅胶有相互作用，展开时易吸附于原点不动或拖尾。氧化铝呈碱性，适用于碱性和中性物质的分离。硅胶和氧化铝1：1量掺和使用，得中性吸附剂，或在制板时加入稀酸或稀碱使其变性，或用酸性或碱性展开剂展开，以改变硅胶或氧化铝原来的性质。,2020/5/8,.,（）样品的极性物质的极性愈大，氧化铝和硅胶吸附愈牢，物质极性大小如下：饱和烃不饱和烃醚酯醛酮胺羟基化合物酸和碱吸附太牢也不易分离，如果硅胶、氧化铝吸附性太强，可掺入不同比例的硅藻土，或其它低吸附性物质。（3）常用吸附剂硅胶：105110活化，但不能高于170。氧化铝：180200活化聚酰胺纤维素硅藻土硅酸镁离子交换剂多孔玻璃珠反相键合硅胶（硅烷化处理）,2020/5/8,.,5-薄层板的制备将吸附剂均匀地涂铺在规定尺寸的玻璃板或其它平面板上，这一过程称铺板或铺层，即制成薄层板。板的好坏是分离成功与否的关键，好的板要求吸附剂涂铺均匀，表面光滑，厚度一致。现有预制板出售。制板方法主要有干法和湿法两种：（1）干法制板氧化铝和硅胶可用干法铺板，干法铺层比较简便，制得的板展开速度快，但展开后不能保存，薄层不牢固，喷显色剂时易吹散。方法：将吸附剂均匀地撒在薄层板上，两手用两端圈套的玻璃棒滚动，厚度0.253mm，滚动不宜太快，不能停。0.25mm左右主要是分析和分离用，3mm的厚板主要是制备色谱用。,2020/5/8,.,（2）湿法铺板在吸附剂中加入少量粘合剂，加水调成糊状制板。湿法制得的半薄层牢固，不易脱落，易保存。氧化铝和硅胶均可用该法铺板，铺成的湿板经风干、活化等处理后即可使用。湿法铺板有三种方法：倾注法、平铺法和涂铺法。倾注法：通过振动铺平，在105120活化0.52h。粘合剂用锻石膏，干燥速度快，用羧甲基纤维素慢。平铺法：二边有框涂铺法：用涂铺器，厚度可调。所用粘合剂有：锻石膏、羧甲基纤维素及某些聚合物如：聚丙烯酸等。锻石膏的用量一般为吸附剂的1015%羧甲基纤维素一般用0.21.0%的水溶液淀粉用5%的水溶液。,2020/5/8,.,（3）薄层板类型除上述正常的硅胶、氧化铝板外，还有一些板适用于化合物的分离和检出：（a）荧光薄层板：吸附剂中加入荧光物质即得荧光板，可检出一些本身无色、在紫外光下也不显荧光的化合物，荧光板在紫外光照射下显荧光，而化合物斑点呈现暗点。无机荧光物质有：在254nm紫外光下激发荧光，如锰激活的硅酸锌（Zn2SiO4:Mn），在365nm紫外光激发荧光，如银激活的硫化锌.硫化镉（ZnS2.CdS:Ag）有机物有荧光素钠、桑色素加入量为0.51.5%（吸附剂中）,2020/5/8,.,（b）络合薄层板含有AgNO3、H3BO3或Na4B4O10等化合物的板与某些化合物在展开过程中形成络合物。如AgNO3络合薄层可用来分离碳原子数相同、而C=C双键数目不等的一系列化合物，如不饱和醇、酸等，原因是Ag+可与C=C形成络合物，饱和的吸附弱，Rf高，双键数目不同，Rf亦不同。含多羟基的长链脂肪酸和它们的甲酯及酚等均可与硼酸、硼砂络合。（c）酸碱薄层板和pH缓冲薄层板：有些化合物在普通板上分离不好时，可通过改变原来吸附剂的酸碱性，改善分离效果。如在铺层时用稀酸（一般用14%的盐酸或0.10.25mol/L草酸溶液）代替水制成酸性板，使生物碱形成离子对而分离。（d）混合薄层板：两种不同吸附剂按一定比例混合，制板，也可分段铺板，前段预处理，以吸附杂质，后段分离。,2020/5/8,.,（e）径向薄层板：径向板铺法与一般板不同，点样前按下法处理：刮去刮去,用此板展开，可使Rf值相近的化合物得到较好的分离，且灵敏度高。（f）梯度薄层板：梯度是指由一种性质到另一种性质的变化。梯度薄层与常规薄层不同，它显示出具有渐变的分离性能，如有两种不同吸附剂的比例渐变（吸附性梯度）；用不同pH值溶液（pH梯度）或AgNO3浓度（0.510%浓度梯度）铺层；用不同粒度吸附剂铺层（粒度梯度）。,2020/5/8,.,（g）烧结板：由玻璃粉（作粘合剂）与硅胶或氧化铝等吸附剂按一定比例混匀后，经高温烧结而成，该板可一此制备多次使用。吸附剂粘合剂配比烧结条件硅胶玻璃粉1：25470770，710min氧化铝玻璃粉1：14470870，710min硅藻土玻璃粉1：16470770，710min（h）旋转薄层板：旋转薄层色谱由称离心薄层色谱，用于快速分离、提纯、制备。（i）聚酰胺薄层板：聚酰胺薄层板一般不需要外加粘合剂，可直接将聚酰胺粉（常用小于60目的粉末）制成匀浆制板，欲提高牢度，可加石膏或淀粉。该种板可以反复使用，再生方法为丙酮和浓氨水（9：1）或丙酮和甲酸（9：1）浸泡6h，洗去污物，再用丙酮洗涤，晾干后即可使用。,2020/5/8,.,（j）纤维素薄层板：薄层用短纤维素制成，斑点集中，天然纤维素长225m，微晶纤维素2040m，铺板可用粘合剂。一般用纤维素与水1：5混匀，铺板，晾干即可，105烘干。（k）反相薄层板：原来反相板是用石蜡处理，现在改用化学键合相硅胶和乙酰化纤维素等制备。（l）高效板：使用窄范围的细粒度硅胶或键合相硅胶铺板，常用粒度范围为57m，厚度一般为0.2mm，高效板分离度和灵敏度高，分析速度快。,2020/5/8,.,点样1.样品浓度溶解样品溶剂避免用水，因水溶液点样斑点易扩散而且不易挥发。一般用有机溶剂，最好与展开剂极性相似的溶剂，应尽量使点样后溶剂迅速挥发；如是水溶液宜边点样、边用电吹风加热吹干；若样品加热不稳定，用冷风吹干。2.点样量点样量多少与纸或薄层的性能、厚度及显色剂的灵敏度有关，点样量对组分的分离效果有很大的影响。点样量少，可能斑点模糊或完全不显出斑点；但点样量过多，斑点过大或拖尾。常用量为几到几十微克，制备型为毫克。,2020/5/8,.,3.点样方式点样要求严格、准确、小心。点样斑点不能太大，否则斑点不集中，影响分离效果和检出限；斑点直径最好35mm。斑点可为点状、也可为条状，距离下端1cm左右。4.点样容器（1）毛细管0.51.0l样品（2）微量注射器（3）专门的点样装置（国外有）：如瑞士Camag公司的Nanomat点样器，Linomat线性点样器。5.展开点样后薄层板须在密闭容器（展开槽）中用适当的展开剂展开，使欲分离的组分彼此分开。,2020/5/8,.,（1）水蒸气的影响水一般不单独作为展开剂，但在展开过程中，空气的相对湿度以及展开槽中的水蒸气必须严格控制，因水和吸附剂之间有巨大的亲和性，即使微量的水也能对色谱分离结果产生较大的影响。硅胶的硅羟基以氢键形式优先吸附水，物理吸附的水阻止了弱极性物质的吸附，从而硅胶活性减弱，化合物的Rf值升高（制成的板要活化，储存于干藻器中，就因为水的影响）。经过活化的板，在点样过程中会立即吸附周围空气中的水份，吸附水份的量决定于点样速度和空气的相对湿度，硅胶板吸水速度很快。0.2mm厚、2020cm板在50%湿度空气中3min就会失去活性一半，15min吸水达最大值。湿度不同，Rf值不同，有差别。此外，适宜的相对湿度范围也决定于溶质和溶剂的极性，极性增加，湿度范围也按比例增大。如苯作展开剂，范围窄，乙醚做展开剂，湿度范围为2050%；氯仿：异丙醇：25%氨水（45：45：10）作展开剂，湿度范围为2080%，重复性好。展开剂极性越大，湿度影响越小。,2020/5/8,.,（2）溶剂蒸气的影响在使用混合溶剂时，由于溶剂挥发性不同，导致极性较弱和沸点较低的溶剂在板的边缘易挥发，故边缘部分的展开剂中极性溶剂的比例增大，Rf值大，中间部分的Rf小，这种现象叫溶剂的“边缘效应”。（3）展开槽可用不锈钢槽和玻璃槽，但不锈钢槽价格高，一般用玻璃槽。玻璃槽有几种形状：（a）普通槽：有立式、卧式，方形、圆形。（b）双底槽：,a,b,c,2020/5/8,.,（4）展开方式（a）近水平展开采用卧式槽，板与槽底部的夹角约510o，下端浸入展开剂0.5cm。适用于不含粘合剂的软板展开。（b）上行展开适用于含粘合剂的硬板，是最常用的方法。（c）下行展开在展开槽内薄层板的上端放一个盛展开剂的槽，用厚滤纸把展开剂引到板的上端，使展开剂从上而下流动。下行展开法展开剂除毛细作用还有重力作用，展开速度快，但操作麻烦。（d）双向展开使板沿一个方向先展开，完成后，取出薄层板，挥发掉展开剂，转90o，沿另一方向再展开。该方法用于组分复杂，性质比较接近的难分离的物质的分离。,2020/5/8,.,5展开剂选择合适的展开剂是分离好坏的关键。1.选择展开剂的方法（1）查阅文献这类方法已有几十年的历史，积累了大量的文献资料，如杂志、期刊、专著、手册等，必要时可以进行改进，可较快地找到合适的展开剂。（2）微量圆环技术在没有合适的展开剂系统参考时，应用微量圆环技术可简便、快速地比较出被试物质在所用展开剂中的移动速度以及最后得到大致的分离效果。,2020/5/8,.,6显色方法和显色剂1.显色方法（1）首先在日光下观察，划出有色物质的斑点位置；（2）在紫外灯下观察有无暗斑或荧光斑点，并记录其颜色、位置及强弱。有荧光的物质或有紫外吸收物质可用此法检出；（3）荧光薄层板检测，适用于有紫外吸收的物质。（4）既无色、又无紫外吸收的物质可用显色剂显色。2.显色剂（1）有机物质通用试剂a.碘蒸汽在浅黄色背景上，很多有机物吸附碘，可逆地产生棕色到黄色斑点，不少有机化合物的检测灵敏度可达0.51ug.,2020/5/8,.,b.10%硫酸乙醇液，喷雾后105度加热10-15分钟，日光或紫外光下观察，大多有机化合物呈有色斑点，如红色、棕色和紫色等，在炭化以前，不同的化合物将出现一系列颜色的改变，被炭化的化合物常出现荧光。c.高锰酸钾-硫酸液配制方法为把500mg高锰酸钾溶在15ml浓硫酸中。注意要少量地慢慢混合，结果为粉底本色上产生白色斑点。d.25%高氯酸水溶液，喷雾后加热至150度左右；e.10%-20%五氯化锑的四氯化碳溶液，或三氯化锑的乙醇饱和溶液。喷雾后，在100-120度加热，日光下和紫外光下观察，该试剂也为有机化合物的通用试剂，和很多有机化合物产生不同的颜色。f.水,2020/5/8,.,（2）专属性显色剂a.含0.3%溴甲酚绿的80%甲醇溶液，在绿色背景下显黄色斑点，表示脂肪族羧酸b.5%磷钼酸乙醇溶液，喷雾后120度烘烤，还原性物质显蓝色，再以氨熏，背景变为无色c.含2%2，4-二硝基苯肼的乙醇溶液，喷雾后120度加热3分钟，醛、酮在黄橙色背景上显红色或橙色斑点；d.含0.3%茚三酮的溶液（含3%的醋酸）用来检测氨基酸及脂肪族伯胺，在白色背景上显粉红色到紫色斑点；e.三氯化铁-铁氰化钾溶液，分别为0.1摩尔/升溶液临用前混合配成，用来检测酚类、芳香族胺类、甾族化合物等。显色剂种类繁多，总数超过300种，详细可查阅有关手册。,2020/5/8,.,6-6定量方法1.刮板、浸取，定量2.扫描仪。,2020/5/8,.,二、柱色谱原理,柱色谱（柱上层析）常用的有吸附色谱和分配色谱两类。吸附色谱常用氧化铝和硅胶作固定相；而分配色谱中以硅胶、硅藻土和纤维素作为支持剂，以吸收较大量的液体作固定相，而支持剂本身不起分离作用。,2020/5/8,.,吸附柱色谱通常在玻璃管中填入表面积很大经过活化的多孔性或粉状固体吸附剂。当待分离的混合物溶液流过吸附柱时，各种成分同时被吸附在柱的上端。,当洗脱剂流下时，由于不同化合物吸附能力不同，往下洗脱的速度也不同，,2020/5/8,.,于是溶质在柱中自上而下按对吸附剂的亲和力大小分别形成若干色带，,再用溶剂洗脱时，已经分开的溶质可以从柱上分别洗出并收集；,或将柱吸干，挤出后按色带分割开，再用溶剂将各色带中的溶质萃取出来。,2020/5/8,.,A,A,B,C,D,E,32,16,16,8,16,8,4,4,12,12,2,2,8,12,8,层析柱分离物质的示意图：,2020/5/8,.,固定