DNA甲基化ppt课件

DNAmethylation,2010.1.20,刘丹,明星熊猫“滚滚”,2,为什么熊猫是黑白的？,基因决定命运,3,1942年，ConradHalWaddington提出表观遗传学(Epigenetics)的概念，以此解释物种的内在基因与外观表现之间的关系。基因序列(Genotype)的改变可能导致功能及表型(Phenotype)的改变。基因型通过一些“偶然的、不确定的机制”决定了不同的表型。生物的不同特征完全随机获得,4,Waddingtonsepigenetics,基因型,表型,5,Waddingtonsepigenetics,基因型,表型,6,DNA双螺旋,7,基因的结构,基因表达受多种因素调控,8,现代表观遗传学概念：基因的DNA序列不发生改变的情况下，基因的表达水平与功能发生改变，并产生可遗传的表型生物的不同特征由基因定向调控表观遗传学的现象（基因表达的调控方式）：DNA甲基化表观遗传学的核心（最初始的调控方式）组蛋白修饰MicroRNAGenomicimprinting,9,真核生物基因表达调控层次：1、DNA水平调节2、转录水平调节3、转录后水平的调节4、翻译水平调节5、翻译后加工的调节,DNA,转录初产物RNA,mRNA,蛋白质前体,mRNA降解物,活性蛋白质,DNA水平调节,转录水平调节,转录后水平的调节,翻译调节,mRNA降解的调节,翻译后加工的调节,核,细胞质,DNA甲基化,10,DNAmethylation的定义,DNAmethylation是唯一发生在哺乳动物细胞内DNA合成后的修饰作用,是调节基因表达的机理之一。DNA甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。,11,12,DNAmethylation的定义,在甲基转移酶（DMNT）的催化下，DNA的CG两个核苷酸中的胞嘧啶（Cytosine）被选择性地添加甲基，形成5-甲基胞嘧啶（5-mC），这常见于基因的5-CG-3序列,DNA甲基化主要形成5-mC和少量的N6-甲基嘌呤（N6-mA）及7-甲基鸟嘌呤（7-mG）,13,结构基因中广泛存在着相邻的两个CG，其中胞嘧啶的5位碳原子通常被甲基化,且两个甲基集团在DNA双链大沟中呈特定三维结构（CpG）,14,CpG岛（cpgisland）结构基因组中70%90%的独立CpG都被甲基化,未甲基化的CpG成簇地聚集形成CpG岛主要位于结构基因的启动子和第一外显子区域，约有60以上基因的启动子含有CpG岛。是结构基因启动子的核心序列和转录起始点,15,CPGisland的功能：通过甲基化与去甲基化，调控下游基因的表达基因表达的调控开关,16,DNAmethylation的生物学功能,在发育和分化中调控基因的表达；特征性表型基因的表达（肤色、毛发）X染色体的失活（X-inactivation）,17,18,DNA甲基化生物学作用,IAP:intracisternalAparticle去甲基化：灰鼠基因（agouti）仅微量表达甲基化：基因超量表达,19,X染色体的失活（X-inactivation）生长发育过程中，雌性哺乳类动物细胞中的两条X染色体其中一条失去活性的现象。避免因拥有两条X染色体而产生双倍的基因产物，保持和雄性动物X染色体数量及功能上的一致性。,20,X染色体上存在一个与X染色体失活有密切联系的核心部位。核心区命名位X染色体失活中心（X-chormosomeinactivationcenter，Xic），其定位在人Xq13区（Barr氏小体浓缩部位）。研究发现失活的染色体上DNA序列都呈高度甲基化，导致绝大多数基因转录处于关闭状态。,21,X-chromosomeinactivation,雌性家猫的一条X染色体完全失去活性,Rainbow,CopyCat,Allie,X染色体失活,22,影响DNAmethylation的调控因素,DNA甲基转移酶(DNMT)的活性哺乳动物体内有三种DNA甲基化转移酶：Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b。DNMT1-持续性DNA甲基转移酶；与甲基化相关，缺乏引起基因组低甲基化，染色体缺失、重排、突变畸形DNMT3a、DNMT3b-从头甲基转移酶；与去甲基化相关，在胚胎干细胞和早期胚胎中高度表达，缺乏引起胚胎死亡，在肿瘤组织中广泛高表达,23,SCIENCEVOL30018APRIL2003,24,正常小鼠(Dnmt1+/+)阳性对照DNM1酶缺乏小鼠模型(Dnmt1chip/)实验组Embryonicstem(ES)细胞(Dnmt1/)阴性对照,25,Dnmt1chip/小鼠Dnmt1酶的表达量明显减少，大约为正常小鼠的10%,26,Dnmt1chip/小鼠体重仅为正常小鼠66%80%的小鼠在4-8个月内产生T细胞性淋巴瘤,27,c-myc癌基因在Dnmt1chip/小鼠中异常高表达,28,影响DNAmethylation的调控因素,组蛋白的甲基化真核生物的组蛋白N末端或C末端氨基酸残基可生乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化等共价修饰，并影响基因转录。H3K9的甲基化与DNA的甲基化在基因的沉默机制中具有协同作用H3K4的甲基化拮抗DNA甲基化所产生的基因沉默,29,影响DNAmethylation的调控因素,RNA干扰一般认为RNA干扰(RNAi)是正常生物体内抑制特定基因表达的一种现象翻译、转录后水平siRNA指导DNA甲基化(RdDM)现象证实：siRNA可以通过DNA甲基转移酶Dnmt1和Dnmt3b介导DNA甲基化DNA水平,30,DNAmethylationandOncology,31,正常生物DNA甲基化,DNA甲基化始发于胚胎早期，随着组织细胞分化发育，基因组DNA经历了去甲基化、区域性的重新甲基化以及组织特异基因选择性的去甲基化的过程。最后，这种DNA甲基化模式就相对稳定下来。,32,肿瘤组织的DNA甲基化,肿瘤中普遍存在DNA甲基化状态的改变，其特点是总体的甲基化水平降低与局部的甲基化水平升高。低甲基化可诱导原癌基因和转座子成分活化，基因印迹缺失以及染色体不稳定性增加，最终诱发肿瘤在整体低甲基化的水平下，某些抑癌基因发生高甲基化，导致基因沉默，对肿瘤抑制能力低下,33,34,DNA甲基化与肿瘤的关系,肿瘤细胞的特征：癌基因低甲基化被激活；抑癌基因高甲基化被沉默甲基化水平与肿瘤生物学特性密切相关，DNA甲基化水平越低，染色体越容易发生功能异常，肿瘤的浸润能力就越高，临床分期也愈晚,35,常见易被甲基化的抑癌基因与修复基因及其作用,36,有学者研究认为,DNA甲基化是继基因结构变异即突变和缺失之后的第3种抑癌基因失活机制。CpG岛保护因子缺乏DNMT3高表达和DNMT复合体调控障碍复制周期时间错误DNA甲基化导致遗传不稳定性。,MilutinovicS,DNAmethyltransferaseinhibitioninducesthetranscriptionofthetumorsuppressorp21(WAF1/CIP1/sdi1)J.JBiolChem,2000,275(9):6353-6359.,37,DNAmethylation的应用前景,肿瘤的早期诊断基因启动子区域的CpG岛甲基化能沉默基因转录，在正常细胞中是一种调节基因表达的手段。然而抑癌基因发生异常甲基化是在肿瘤早期就发生而且一直进行的，导致恶性肿瘤表型的表达,38,DNAmethylation的应用前景,39,40,DNAmethylation的应用前景,Kuester报道在88.19%(24/27)食管Barretts化生病例和100%(13/13)的上皮内瘤变病例中检测到MGMT基因异常甲基化，提示MGMT甲基化是食管腺癌早期频繁发生的事件。Kelavkar等发现ALDX15基因在前列腺上皮内瘤变、前列腺癌中以异常甲基化存在；而在正常前列腺细胞系中是以非甲基化状态存在，说明其异常甲基化与前列腺癌的发生关系密切。,1.KUESTERD,etal.SilencingofMGMTexpressionbypromoterhypermethylationinthemetaplasia-dysplasia-carcinomasequenceofBarrettsesophagus.CancerLett,2009,275(1):117-126.2.KELAVKARP,etal.DNAmethylationparadigmshift:15-Lipoxygenase-1upregulationinprostaticintraepithelialneoplasiaandprostatecancerbyatypicalpromoterhypermethylation.ProstaglandinsOtherLipidMediat,2007,82(1-4):185-197.,41,DNAmethylation的应用前景,优点：DNA甲基化检测具有早期、无创、快捷、灵敏度高等特点。（血液、粘膜上皮标本）缺点：特异性不足,42,DNAmethylation的应用前景,肿瘤的预后分析甲基化改变与肿瘤分级、分期有明显的相关性。RASSF1A甲基化在低分化肺癌中比在高分化中更常见在结直肠癌Dukes分期C和D的病例中CDKN2A,p16的甲基化率比A和B期的增高,DASPM,DNAmethylationandcancer.JClinOncol,2004,22(22):4632-4642,43,DNAmethylation的应用前景,DNA异常甲基化可促进肿瘤的侵袭和转移乳腺癌中CyclinD2,RAR-,Twist,RASSF1A和HIN-1的甲基化改变与淋巴结、骨、脑、肺转移有关,MEHROTRAJ,etal.Veryhighfrequencyofhypermethylatedgenesinbreastcancermetastasistothebone,brain,andlung.ClinCancerRes,2004,10(9):3104-3109.,44,DNAmethylation的应用前景,甲基化可作为肿瘤复发的独立预测因子。口腔鳞状细胞癌时存在RECK基因甲基化的患者复发率明显增高甲基化影响生存期膀胱癌中APC,GSTP1和TIG1基因发生异常甲基化时,患者存活时间明显缩短,LONGNK,etal.HypermethylationoftheRECKgenepredictspoorprognosisinoralsquamouscellcarcinomasJ.OralOncol,2008,44(11):1052-1058.ELLINGERJ,etal.HypermethylationofCel-FreeSerumDNAIndicatesWorseOutcomeinPatientsWithBladderCancer.JUrol,2008,179(1):346-352.,45,DNAmethylation的应用前景,肿瘤的去甲基化治疗DNA甲基化程度依赖于DNMT活性。正常甲基化模式的建立需要DNMT1和DNMT3的共同作用，DNMT1是DNMT3启动CpG核苷酸从头甲基化的保证，而DNMT3则使甲基化水平稳定在正常需要水平（去甲基化）抑制DNMT活性药物是治疗肿瘤的新希望,46,胞苷类似物通过共价键与DNMT形成不可逆的复合物从而竞争性抑制其活性,使