第七章 微生物遗传变异

第七章微生物的遗传变异和育种,遗传：,亲代与子代相似,变异：,亲代与子代、子代间不同个体不完全相同,遗传（inheritance）和变异（variation）是生命的最本质特性之一,遗传型：,表型：,生物所携带的全部遗传因子或者基因的总称,具有一定遗传型的个体，在特定环境条件下通过生长发育所表现出来的形态特征和生理特征的总和。,表型是由遗传型所决定，但也和环境有关。,表型饰变：,表型的差异，只与环境有关,Productionofaredpigment(prodigiosin)bySerratiamarcescens.Fromlefttoright:slantculturegrownat25C,slantculturegrownat37C,brothculturegrownat25C,brothculturegrownat37C.,特点：表现为全部个体的行为，变化幅度小；暂时性、不可遗传性。,遗传型变异（基因变异、基因突变）：,遗传物质改变，导致表型改变。特点：群体中极少数个体的行为（自发突变频率通常为10-6-10-9）；遗传性（稳定性）,微生物是遗传学研究中的明星：,微生物细胞结构简单，营养体一般为单倍体，方便建立纯系；很多常见微生物都易于人工培养，快速、大量生长繁殖，易于积累不同的代谢产物和中间代谢物，菌落形态具有可见性与多样性；物种和代谢类型多样；对环境因素的作用敏感，易于获得各类突变株，操作性强。,第一节遗传变异的物质基础,一、三个证明DNA是遗传物质的经典实验1、经典转化实验肺炎链球菌：S型（菌体具荚膜，菌落表面光滑，有致病能力）R型（菌体无荚膜，菌落表面粗糙，无致病能力）,1928年，F.Griffth作了3组实验:,实验说明：加热杀死的S型细菌，其细胞内存在一种具有遗传转化能力的物质，以某种方式进入R型细菌，使之转化为S型细菌。,1944年，Avery精确重复了转化实验，确定了转化因子,实验证明，将R菌转化为S菌的转化因子是DNA；而且DNA纯度越高，转化效率也越高。,2、噬菌体感染实验,实验证明，进入细菌细胞内部的物质是DNA。DNA包含有产生完整噬菌体的全部信息。,3、植物病毒重建实验,实验证明，遗传信息的流向与核酸的传递是一致的。,二、遗传物质在微生物细胞内存在的部位和方式（一）遗传物质在7个水平上的形式1、细胞水平2、细胞核水平3、染色体水平4、核酸水平5、基因水平6、密码子水平7、核苷酸水平,1、细胞水平真核微生物：细胞核原核微生物：核质体细胞核或核区的数目在不同的微生物中是不同的,2、细胞核水平真核生物细胞核核染色体原核生物核区DNA链,核基因组,在核基因组之外，还存在各种形式的核外遗传物质,质粒,3、染色体水平染色体是由组蛋白与DNA构成的线状结构；染色体的数目在不同的生物中是不同的；染色体的倍数在同一生物的不同生活时期是不同的；单倍体二倍体,4、核酸水平核酸种类：DNA，RNA染色体核酸结构：双链、单链；环状，线状，超螺旋状DNA长度：因种而异,微生物基因组测序工作是在人类基因组计划的促进下开始的，最开始是作为模式生物，后来不断发展，已成为研究微生物学的最有力的手段。,5、基因水平基因是生物体内一切具有自主复制能力的最小遗传功能单位，其物质基础是一条以直线排列、具有特定核苷酸序列的核酸片段，众多基因，构成染色体。每个基因的长度大体在1000-1500bp。,结构基因调节基因,原核生物的基因通过基因调控系统起作用的。基因调控系统由一个操纵子和它的调节基因组成。每一操纵子包括3种功能上相关的基因：结构基因、操纵基因和启动基因。,真核生物的基因无操纵子结构，存在着大量不编码序列和重复序列。,内含子外显子,微生物基因组结构的特点,、原核生物（细菌、古生菌）的基因组,1）染色体为双链环状的DNA分子（单倍体）；2）基因组上遗传信息具有连续性；一般不含内含子，遗传信息是连续的而不是中断的。3）功能相关的结构基因组成操纵子结构；4）结构基因的单拷贝及rRNA基因的多拷贝；5）基因组的重复序列少而短；个别细菌(鼠伤寒沙门氏菌和犬螺杆菌)和古生菌的rRNA和tRNA中也发现有内含子或间插序列。,、真核微生物（啤酒酵母）的基因组,1）典型的真核染色体结构；2）没有明显的操纵子结构；3）有间隔区（即非编码区）和内含子序列；4）重复序列多。,、原核生物和真核生物的基因组比较,6、密码子水平,遗传密码是指DNA链上决定各具体氨基酸的特定核苷酸排列顺序。遗传密码的信息单位是密码子。每一密码子由3个核苷酸序列，即1个三联体组成。密码子一般用mRNA上3个连续核苷酸序列来表示。,7、核苷酸水平核苷酸是最小突变单位和交换单位绝大多数生物的DNA组分中，含有四种核苷酸：腺苷酸（AMP）、胸苷酸（TMP）、鸟苷酸（GMP）、胞苷酸（CMP）。RNA组分中，含有四种核苷酸：腺苷酸（AMP）、尿苷酸（UMP）、鸟苷酸（GMP）、胞苷酸（CMP）。,（二）原核生物的质粒,1、定义质粒（plasmid）：一种独立于染色体外，能进行自主复制的细胞质遗传因子，主要存在于各种微生物细胞中。质粒所含的基因对宿主细胞一般是非必需的；在某些特殊条件下，质粒有时能赋予宿主细胞以特殊的机能，从而使宿主得到生长优势。例：接合、产毒、固氮、解毒、抗药,2、结构特点通常以共价闭合环状(covalentlyclosedcircle，简称CCC)的超螺旋双链DNA分子存在于细胞中；也发现有线型双链DNA质粒和RNA质粒；质粒分子的大小范围从1kb左右到1000kb；（细菌质粒多在10kb以内）,3、质粒的类型,严密型质粒(stringentplasmid)：复制行为与核染色体的复制同步，低拷贝数松弛型质粒(relaxedplasmid)：复制行为与核染色体的复制不同步，高拷贝数,窄宿主范围质粒(narrowhostrangeplasmid)（只能在一种特定的宿主细胞中复制）,广宿主范围质粒(broadhostrangeplasmid)（可以在许多种细菌中复制）,4、质粒在基因工程中的应用质粒的优点：（1）体积小，易分离和操作；（2）环状，稳定；（3）独立复制；（4）拷贝数多；（5）存在标记位点，易筛选E.coli的pBR322质粒是一个常用的克隆载体,pBR322质粒,优点：（1）体积小，仅4361bp；（2）宿主细胞中稳定维持高拷贝；（3）一定条件下可扩增至1k-3k个；（4）分离极其容易；（5）可插入较多外源DNA；（6）结构完全清楚；（7）有两个选择性抗药标记；（8）很方便通过转化导入宿主细胞。,5、质粒的分离与检测,提取所有胞内DNA后电镜观察；,超速离心或琼脂糖凝胶电泳后观察；,对于实验室常用菌，可用质粒所带的某些特点，如抗药性初步判断。,分离：细胞裂解、蛋白质和RNA的去除、质粒与染色体DNA分离等。,检测：,质粒可以从菌体内自行消失，也可以通过物理化学手段，如重金属、吖啶类染料或高温处理使其消除或抑制。没有质粒的细菌可以通过接合、转化或转导等方式从具有质粒的细菌中获得，但不能自发产生。,6、质粒的主要种类,质粒所编码的功能和赋予宿主的表型效应,致育因子（Fertilityfactor，F因子）抗性因子（Resistancefactor，R因子）产细菌素的质粒（Bacteriocinproductionplasmid）毒性质粒（virulenceplasmid）代谢质粒（Metabolicplasmid）隐秘质粒（crypticplasmid）,致育因子(Fertilityfactor，F因子),又称F质粒，其大小约100kb，这是最早发现的一种与大肠杆菌的有性生殖现象（接合作用）有关的质粒。,携带F质粒的菌株称为F+菌株（相当于雄性），无F质粒的菌株称为F-菌株（相当于雌性）。,F因子能以游离状态(F+)和以与染色体相结合的状态(Hfr)存在于细胞中，所以又称之为附加体(episome)。,抗性因子（Resistancefactor，R因子）,包括抗药性和抗重金属二大类，简称R质粒。抗性质粒在细菌间传递是细菌产生抗药性的重要原因之一。,R质粒,抗性转移因子（RTF）：转移和复制基因抗性决定因子：抗性基因,R100质粒(89kb)可使宿主对下列药物及重金属具有抗性：汞（mercuricion，mer）、磺胺(Sulfonamide,Sul)、链霉素(Streptomycin,Str)、夫西地酸（fusidicacid，fus）、氯霉素(Chlorampenicol,Cml)、四环素（tetracycline，tet）并且负责这些抗性的基因是成簇地存在于抗性质粒上。,产细菌素的质粒（Bacteriocinproductionplasmid）,细菌性的蛋白类毒素，能杀死其他细菌。,一般都位于质粒或转座子上，因此，细菌素可以杀死同种但不携带该质粒的菌株。,细菌素一般根据产生菌的种类进行命名：大肠杆菌（E.coli）产生的细菌素为colicins（大肠杆菌素），而质粒被称为Col质粒。,细菌素结构基因涉及细菌素运输及发挥作用的蛋白质的基因、赋予宿主对该细菌素具有“免疫力”的相关产物的基因。,毒性质粒（virulenceplasmid）,许多致病菌的致病性是由其所携带的质粒引起的，这些质粒具有编码毒素的基因，其产物对宿主（动物、植物）造成伤害。,产毒素大肠杆菌是引起人类和动物腹泻的主要病原菌之一，其中许多菌株含有为一种或多种肠毒素编码的质粒。,苏云金杆菌含有编码内毒素(伴孢晶体中)的质粒。,根癌土壤杆菌所含Ti质粒是引起双子叶植物冠瘿瘤的致病因子。,根癌土壤杆菌-Ti质粒,植物冠瘿瘤,Ti质粒（tumorinducingplasmid）,诱癌质粒；根癌土壤杆菌的Ti质粒可引起许多双子叶植物的根癌；含有复制基因的Ti质粒的小片段与植物细胞中的核染色体组发生整合，破坏控制细胞分裂的激素调节系统，从而使它转变成癌细胞。,Ti质粒中的T-DNA可携带任何外源基因整合到植物基因组中，是植物基因工程中有效的克隆载体。,代谢质粒（Metabolicplasmid）,质粒上携带有有利于微生物生存的基因，如能降解某些基质的酶，进行共生固氮，或产生抗生素（某些放线菌）等。,将复杂的有机化合物降解成能被其作为碳源和能源利用的简单形式，环境保护方面具有重要的意义。,降解质粒：,降解性质粒,只在Pseudomonas（假单胞菌属）中发现。它们的降解性质粒可为一系列能降解复杂物质的酶编码，从而能利用一般细菌所难以分解的物质作碳源。这些质粒以其所分解的底物命名，例如有分解CAM（樟脑）质粒，OCT（辛烷）质粒，XYL（二甲苯）质粒，SAL（水杨酸）质粒，MDL（扁桃酸）质粒，NAP（萘）质粒和TOL（甲苯）质粒等。,假单胞菌：具有降解一些有毒化合物，如芳香族化合物(苯)、农药(2,4-二氯苯氧乙酸dichlorophenoxyaceticacid)、辛烷和樟脑等的能力。,隐秘质粒（crypticplasmid）,隐秘质粒不显示任何表型效应，它们的存在只有通过物理的方法，例如用凝胶电泳检测细胞抽提液等方法才能发现。它们存在的生物学意义，目前几乎不了解。,在应用上，很多隐秘质粒被加以改造作为基因工程的载体（一般加上抗性基因）,Ri质粒（rootinducingplasmid),发根土壤杆菌可侵染双子叶植物的根部，并诱生大量不定根；Ri质粒中的一段T-DNA整合到宿主根部细胞的核基因组中。,mega质粒,在Rhizobium（根瘤菌属）中发现的一种质粒，分子量为200300106Da，比一般质粒大几十倍至几百倍，故称巨大质粒，其上有一系列固氮基因。,第二节基因突变和诱变育种,一、基因突变一个基因内部遗传结构或DNA序列的任何改变、可遗传、自发或诱变产生。,基因突变,狭义：点突变广义：基因突变和染色体畸变,染色体畸变：染色体的添加、重复、易位、倒位,（一）突变类型,营养缺陷型又称营养突变型（auxotrophmutant）指某一野生型菌株因发生基因突变而丧失合成一种或几种生长因子、碱基或氨基酸的能力，因而无法再在基本培养基上正常生长繁殖的变异类型。抗性突变型（resistantmutant）指野生型菌株因发生基因突变，而产生的对某化学药物或致死物理因子的抗性变异类型。条件致死突变型（conditionallethalmutant）某菌株或病毒经基因突变后，在某种条件下可正常地生长、繁殖，并呈现其固有的表型，而在另一种条件下却无法生长、繁殖，这种突变类型称为条件致死突变型。温度敏感突变型（Ts）,形态突变型（morphologicalmutant）指由突变引起的个体或菌落形态的变异。例如：细菌的鞭毛或荚膜的有无，菌落的大小、外形的光滑、粗糙和颜色的变化，放线菌或霉菌孢子的有无或颜色变化。抗原突变型（antigenicmutant）指由于基因突变引起的细胞抗原结构（细胞壁、糖被、鞭毛）发生的变异类型。产量突变型（metabolitequantitativemutant）通过基因突变而产生的在代谢产物产量上明显有别于原始菌株的突变株。有正突变和负突变之分。,（二）突变率（mutationrate）,每一细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率，称突变率。突变一般是独立发生的。某一基因发生突变不会影响其他基因的突变率。突变率一般为10-6-10-9。突变的检出采用检出营养缺陷型的回复突变株或抗性突变株的方法来加以测定。,（三）基因突变的特点,自发性:指可自发地产生突变。不对应性：指突变性状与引起突变的原因间无对应关系。稀有性：通常自发突变的几率在10-6-10-9间。独立性：某种基因的突变率不受它种基因突变率的影响。例：巨大芽孢杆菌突变率抗异烟肼510-5抗氨基柳酸110-6双抗810-10,诱变性：自发突变的频率可因诱变剂的影响而大为提高。稳定性：基因突变后的新遗传性状是稳定的。可逆性：野生型菌株某一性状可发生正向突变，也可发生相反的回复突变。,基因突变的特点,（四）基因突变自发性和不对应性的实验证明,三个经典实验变量实验涂布实验影印实验,证明突变是自发产生的，并且突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系。,野生型（原始性状）,特定环境,突变型（适应环境的新性状）,驯化,定向诱变,筛选,？,？,？,突变的原因,？,变量实验（fluctuationanalysis）SalvadorLuriaandMaxDelbruck（1943）,SalvadorLuria,MaxDelbruck,TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1969,1.变量实验（fluctuationanalysis）,抗噬菌体性状的突变不是有环境因素诱导出来的，而是接触噬菌体之前在某一次细菌分裂过程中就随即发生了。噬菌体仅起着淘汰原始的未突变的敏感菌和鉴别抗噬菌体突变的作用。,2.Newcombe的涂布实验（1949）,抗性突变在接触T1之前就发生了发生了。噬菌体仅起着淘汰原始的未突变的敏感菌和鉴别抗噬菌体突变的作用，不是诱发突变的原因。,3.影印实验（replicaplating）JoshuaLederbergandEstherLederberg（1952）,JoshuaLederberg,J.LederbergisawardedtheNoblePrizeinMedicineandPhysiologyin1958,影印平板培养法：一种通过盖章的方式，使在一系列培养皿的相同位置能出现相同菌落的接种培养方法。,（五）基因突变及其机制,诱变剂,物理诱变剂,化学诱变剂,-射线、-射线、-射线、x-射线、快中子紫外线,烷化剂碱基类似物吖啶化合物,1、诱发突变：物理、化学和生物的因素，提高突变率。,非电离辐射：,电离辐射：,（1）辐射对遗传物质的作用机制,电离辐射的作用机制,直接作用：当射线作用于生物时，首先从细胞中各种原子或分子的外层击出电子，在射线径迹中的细胞中产生很多离子对，引起细胞内原子或分子的电离和激发。当细胞内的染色体或DNA分子被射线作用产生电离和激发时，便会引起这些遗传物质的改变。,间接作用,H2O电离辐射H2O+eH2O+eH2O-H2O+H+OH0OH0+OH0H2O2H2OH0+OH-H0+O2HO20,水的射解作用,过氧基,集中于染色体变化方面，主要是由于DNA经辐射而发生碱基的改变，糖和磷酸基的改变或键的不同变化并造成染色体的断裂，然后通过末端的不同连接状况形成缺失、重复、易位和断片等染色体的结构变异，从而导致表型的突变。在细胞质方面，可使之渗透性提高，粘性加大，甚至影响到一些酶的性质，造成代谢过程的紊乱，破坏细胞的正常功能，最终出现遗传变异。,电离辐射的作用机制,电离辐射的遗传学效应的特点：,辐射诱发的基因突变和染色体断裂频率在一定范围内与辐射剂量成正比；辐射效应有积累作用。,引起DNA变化：DNA链的断裂、DNA分子内和分子间的交联、DNA与蛋白质的交联、碳的水合作用及嘧啶二聚体的形成。,非电离辐射的作用机制,紫外线：被物质吸收后，只要会引起分子内的电子产生激发而变成激发分子或活化分子。正常分子获得能量成为活化分子后，可能发生化学变化。,（2）化学诱变剂的作用机制,特点：损伤小，诱变频率较低，突变谱不广而可育的有利突变较多；具有特异性，即一定性质的诱变剂能诱发一定类型的变异。,碱基的置换,诱变剂,直接引起置换的诱变剂一类可直接与核酸的碱基发生化学反应的诱变剂，不论在机体内或是在离体条件下均有作用。例如亚硝酸、羟胺和各种烷化剂。间接引起置换的诱变剂通过活细胞的代谢活动掺入到DNA分子中后而引起的。诱变剂是一些碱基类似物，如5-溴尿嘧啶（5-BU）、5-氨基尿嘧啶（5-AU）。,碱基的置换引起的突变,例：人血红蛋白链第6个AA发生突变正常异常（颠换）异常（转换）DNACTTCATTTTmRNAGAAGUAAAA蛋白质正常Vallys镰刀型贫血症轻度贫血,错义突变：当碱基替代产生出一个能转译出另一种AA的密码时，在蛋白质的一级结构中便会出现一个AA的差异，有时会引起明显的变化。,例：正常异常DNAATGATTmRNAUACUAA蛋白质Tyr终止,无义突变有时碱基替代会产生一个终止密码，多肽链的合成会半途停止，形成一条不完全的多肽链，使蛋白质失去活性或正常的代谢功能。,例：无义突变正常同义突变mRNAUAGUACUAGtRNA-AUGAUC蛋白质终止TyrTyr,同义突变由于tRNA基因突变引起反密码子改变，有时会“以错就错”的转译出某种蛋白质，表现出抑制突变的效应，又称为抑制突变。,移码突变诱变剂会使DNA序列中的一个或几个核苷酸发生增添或缺失，从而使该处后面的全部遗传密码的阅读框架发生改变，并进一步引起转录和转译错误的一类突变。,吖啶类染料是移码突变的有效诱变剂,错误+错误-+正常-正常+正常,染色体畸变：缺失、重复、插入、易位、倒位,转座,DNA序列通过非同源重组的方式，从染色体某一部位转移到同一染色体上另一部位或其他染色体上某一部位的现象。转座因子主要有三类插入序列（IS，insertionsequence）转座子（Tn，transposon，又称转位子，易位子）Mu噬菌体（即mutatorphage，诱变噬菌体）,例：P211表7-6,2、自发突变：没有人为因素下自然发生的低频率突变。原因：（1）背景辐射：短波辐射、高温、低浓度的诱变物质等（2）有害产物积累：过氧化氢（3）碱基错配,嘧啶对紫外线的敏感性要比嘌呤强得多。嘧啶的光化产物主要是二聚体和水合物；紫外线的主要作用是使同链DNA的相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体。,（六）紫外线对DNA的损伤及其修复,DNA的修复,（1）光复活作用（photoreactivation）把经紫外线照射后的微生物立即暴露于可见光下时，可明显降低其死亡率的现象；光解酶（光裂合酶）；一般的微生物中都存在着光复活作用；紫外线诱变育种时，只能在红光下进行。,（2）暗修复作用（darkrepair）又称切除修复（excisionrepair）有四种酶参与内切核酸酶外切核酸酶DNA聚合酶连接酶,（3）重组作用,特点：不需要立即从亲代的DNA分子中去除损伤的部位，仍能保证DNA复制的继续进行。,重组蛋白,DNA聚合酶,DNA连接酶,微生物育种的目的是人为地使某种代谢产物过量积累，最大程度降低成本，把生物合成的途径朝人们所希望的方向引导，最终获得高产、优质和低耗的菌种。微生物育种所经历的大致历程：从生产中选育或定向培育选育（未采用诱变剂，自发突变株）采用诱变剂进行诱变，提高突变频率，筛选有用菌株利用接合、原生质体融合等技术使基因发生重组（细胞水平）体外DNA重组技术（基因工程技术）创造具有新的生物性状的生物,二、突变与育种,（一）自发突变与育种：主要是通过实践经验选择生产中发生自发突变的菌株或不断转接微生物菌株以期获得其自发突变菌株。生产中选育例：宇佐美曲霉-上酒白种定向培育例：卡介苗的筛选，连续接种230代特点：费时、费力，工作被动，守株待兔式的，效果难以确定,（二）诱变育种,指利用物理、化学等诱变剂处理均匀而分散的微生物细胞群，在促进其突变率显著提高的基础上，采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选出少数符合目的的突变株，以供科学实验或生产实践使用。,诱变育种的意义,应用方面，可获得各种突变菌株；生产方面，既能大幅度提高有用代谢产物的产量，又能达到减少杂质、提高质量、扩大品种和简化工艺的目的；方法方面，具有简便易行、条件设备要求低等优点。,1、诱变育种的基本环节,2、诱变育种的原则（1）使用简便有效的诱变剂,诱变剂,物理因素,化学因素,紫外线激光离子束X射线、射线快中子,烷化剂碱基类似物吖啶化合物,Ames试验：利用细菌模型了解潜在化学致癌物的诱变作用。,“生物化学统一性”法则：人和细菌在DNA的结构及特性方面是一致的，能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA，使其发生突变，最后造成癌变或其他不良的后果。,诱变剂的共性原则：化学药剂对细菌的诱变率与其对动物的致癌性成正比。超过95%的致癌物质对微生物有诱变作用90%以上的非致癌物质对微生物没有诱变作用,美国加利福尼亚大学的BruceAmes教授于1966年发明，因此称为Ames试验。具体操作：检测鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphmurium)组氨酸营养缺陷型菌株(his-)的回复突变率。回复突变：突变体失去的野生型性状，可以通过第二次突变得到恢复，这种第二次突变称为回复突变。,证明Ames试验重要性的应用实例：国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物“反应停”，由于其药效显著，在60-70年代十分流行。但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高，而且生产畸形儿的妇女大多曾服用“反应停”，后来采用Ames试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用，因此这种药物被禁止使用。但如果能在这种药物上市之前就进行Ames试验检测，那么这种大量出生畸形儿的悲剧完全可以避免。,常用诱变剂是紫外线和亚硝基胍。紫外线：无菌，红光下进行紫外诱变箱：高30-40cm，15w紫外灯管装有磁力搅拌器的小平皿分散均匀的单细胞悬液一定的照射时间：死亡率60%-70%照射完毕立即梯度稀释进行选择。,（2）选用优良的出发菌株,仅凭经验:来自生产中的自发突变菌株；具有有利于进一步研究或应用性状的菌株；已发生其他突变的菌株；对诱变剂敏感性较高的增变变异株。,（3）处理单细胞或单孢子悬浮液不纯菌落:多核、dsDNA表型延迟表型延迟：遗传型虽已改变，但表型却要经染色体复制、分离和细胞分开才表现出来的现象。细菌一般以对数期为最好；霉菌或者放线菌的孢子稍加萌发后再进行诱变可以提高诱变率。无菌的玻璃珠打碎成团的细胞，再用脱脂棉过滤。诱变后的不纯菌落可用适当的纯种分离方法加以分离纯化。,（4）使用最佳诱变剂量剂量=强度（浓度）作用时间相对剂量=杀菌率在产量性状的诱变育种中，凡在提高诱变率的基础上，既能扩大变异幅度，又能促使变异移向正变方向的剂量，就是合适的剂量。两条重要的试验曲线：剂量存活率曲线剂量-诱变率曲线研究发现正突变较多地出现在偏低的剂量中，而负突变较多地出现在偏高的剂量中。在用紫外线做诱变剂时，倾向采用相对杀菌率为70%-75%的剂量。,（5）充分利用复合处理的协同效应,两种或多种诱变剂先后使用；同一诱变剂的重复使用；两种或多种诱变剂的同时使用。例：单独处理复合处理土曲霉紫外线21.3x射线19.742.8链霉菌紫外线31.0射线35.043.6,（6）寻找和利用形态、生理与产量间的相关指标,琼脂平板上：蛋白酶水解圈淀粉酶变色圈氨基酸显色圈柠檬酸变色圈抗生素抑制圈外毒素沉淀圈生长因子生长圈,（7）设计高效率筛选方案初筛：选取较多有生产潜力的菌株；复筛：对少量潜力大的菌株的代谢产物量作精确测定,（8）根据具体情况创造新型筛选方案,对产量突变株生产性能的测定方法:初筛：以粗测为主，摇瓶或者平板培养平板培养：快速、简便、直观，但其培养条件不一定与摇瓶和发酵罐的条件一致。复筛：对产量突变株作生产性能的精确测定摇瓶或者发酵罐,3、突变株的筛选：（1）产量突变株的筛选（2）抗药性突变株的筛选（3）营养缺陷型突变株的筛选,产量突变株的筛选,（2）抗药性突变株的筛选,例：异烟肼是一种抗代谢药物，能阻止敏感菌的生长，而吡哆醇是异烟肼的结构类似物，不能阻止敏感菌的生长，当敏感菌能在含异烟肼的培养基上生长时，可能是产生了能分解异烟肼的酶类的突变株或者是能合成更高浓度的吡哆醇，克服了异烟肼的竞争性抑制，所以用梯度平板法可以筛选到高产吡哆醇的突变株。,梯度平板法：是定向筛选抗药性突变株的一种有效方法，通过制备琼脂表面存在药物浓度梯度的平板、在其上涂布诱变处理后的细胞悬液、经培养后再从其上选取抗药性菌落等步骤，就可定向筛选到相应抗药性突变株。,例:P220表7-8,（3）营养缺陷突变株的筛选,与筛选营养缺陷突变株有关的三类培养基基本培养基（MM,minimalmedium）:仅能满足某微生物的野生型菌株生长所需要的最低成分的组合培养基；完全培养基（CM，completemedium）：可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组合培养基。补充培养基（SM,supplementalmedium）：只能满足相应的营养缺陷型突变株生长需要的组合或半组合培养基。,与筛选营养缺陷突变有关的三类遗传型个体野生型（wildtype）：指从自然界分离到的任何微生物在其发生人为营养缺陷突变前的原始菌株，可在基本培养基上生长。营养缺陷型（auxotroph）：野生型菌株经诱变剂处理后，由于发生了丧失某酶合成能力的突变，因而只能在加有该酶合成产物的培养基中才能生长。原养型（prototroph）：营养缺陷型突变株经回复突变或重组后产生的菌株。其营养要求与野生型相同。,营养缺陷型突变株的筛选方法,诱变,检出营养缺陷型,淘汰野生型,鉴定营养缺陷型,富集培养（抗生素法）（菌丝过滤法）,夹层培养法限量补充培养法逐个检出法影印平板法,生长谱法,淘汰野生型抗生素法：青霉素适用于细菌；制霉菌素适用于真菌。菌丝过滤法：适用于进行丝状生长的真菌和放线菌。检出缺陷型夹层培养法限量补充培养法逐个检出法影印平板法,夹层培养法限量补充培养法逐个检出法影印平板法,鉴定营养缺陷型生长谱法,指在混有供试菌的平板表面点加微量营养物，视某营养物的周围是否长菌来确定供试菌的营养要求的一种快速、直观的方法。,碳源,氮源,生长因子,无机盐,营养缺陷型突变株的意义,科学实验中既可作为研究代谢和杂交、转化、转导、原生质体融合、质粒和转座因子等遗传规律必不可少的标记菌株，也可作为氨基酸、维生素或碱基等物质生物测定的实验菌株；生产实践中既可直接用作生产核苷酸、氨基酸等代谢产物的生产菌株，也可作为生产菌株杂交、重组育种时不可缺少的带有特定基因标记的亲本菌株。,基因重组（generecombination）：把两个独立基因组内的遗传基因，通过一定的途径转移到一起，形成新的稳定基因组的过程，称为基因重组或遗传重组。基因重组是杂交育种的理论基础，由于杂交育种是选用已知性状的供体菌和受体菌作亲本，因此具有方向性和自觉性（相对于诱变育种）。,第三节基因重组和杂交育种,一、原核生物的基因重组,原核生物基因重组的特点：片段性，仅一小段DNA序列参与重组；单向性，从供体菌向受体菌作单方向转移；转移机制独特而多样。,（一）转化,1928年，Griffith发现肺炎链球菌（Streptococcuspneumoniae）的转化现象,目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化的能力，种类很普遍。,受体菌（receptor）直接接受供体（donor）的DNA片段而获得供体菌部分遗传性状的现象。通过转化方式形成的杂种后代，称为转化子。,1、建立了感受态的受体细胞感受态细胞：具有摄取外源DNA能力的细胞自然感受态的出现是细胞一定生长阶段的生理特性，受细菌自身的基因控制；人工感受态则是通过人为诱导的方法，使细胞具有摄取DNA的能力，或人为地将DNA导入细胞内.,进行自然转化，需要二方面必要的条件：,感受态因子：调节感受态的一类特异蛋白称感受态因子。包括膜相关DNA结合蛋白、细胞壁自溶素和几种核酸酶。,2、外源游离DNA分子（转化因子）,本质是离体的DNA片段。原核生物的核基因组在自然或人为条件下都易断裂成碎片，从而成为转化因子。转化因子通常有15kb左右的片段。不同的微生物中，转化因子的形式也不同。一般情况下，最易与细胞表面结合的是dsDNA，但进入细胞后就会被降解成ssDNA，才能与受体菌的基因组整合。,转化过程（革兰氏阳性菌的转化模型）,转化过程的特点：a）对核酸酶敏感；b）不需要活的DNA供体细胞；c）转化是否成功及转化效率的高低主要取决于转化供体菌株和转化受体菌株之间的亲源关系；d）通常情况下质粒的自然转化效率要低得多。,噬菌体DNA被感受态细胞摄取并产生有活性的病毒颗粒的现象。,转染(transfection),转染的特点：提纯的噬菌体DNA以转化的（而非感染）途径进入细胞并表达后产生完整的病毒颗粒。,人工转化,用CaCl2处理细胞，电穿孔等是常用的人工转化手段。,在自然转化的基础上发展和建立的一项细菌基因重组手段，是基因工程的奠基石和基础技术。,不是由细菌自身的基因所控制；,用多种不同的技术处理受体细胞，使其人为地处于一种可以摄取外源DNA的“人工感受态”。,质粒的转化效率高,（二）细菌的转导（transduction）,通过缺陷噬菌体的媒介，把供体细胞的小片段DNA携带到受体细胞中，通过交换与整合，使后者获得前者部分遗传性状的现象。,细菌转导的类型,普遍转导,局限转导,完全普遍转导流产普遍转导,低频转导高频转导,1.普遍转导（generalizedtransduction）,噬菌体可以转导供体菌染色体的任何部分到受体细胞中的转导过程。,普遍性转导的三种后果：,外源DNA被降解，转导失败。,进入受体的外源DNA通过与细胞染色体的重组交换而形成稳定的转导子。,流产转导,完全普遍转导,流产普遍转导经转导噬菌体的媒介而获得了供体菌DNA片段的受体菌，如果这段外源DNA在其内既不进行交换、整合和复制，也不迅速消失，而仅表现稳定的转录、转译和性状表达，这一现象就称流产转导。,定义：指通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中，并与后者的基因组整合、重组，形成转导子的现象。,2、局限转导,特点：（1）只局限于传递供体菌核染色体上的个别特定基因；（2）该特定基因由部分缺陷的温和噬菌体携带；（3）缺陷噬菌体的形成方式是由于它在脱离宿主核染色体过程中发生低频率的误切或由于双重溶源菌的裂解而形成;（4）局限噬菌体的产生要通过UV等因素对溶源菌的诱导引起裂解后才产生。,局限转导,温和噬菌体感染,整合到细菌染色体的特定位点上宿主细胞发生溶源化,溶源菌因诱导而发生裂解时，在前噬菌体二侧的少数宿主基因因偶尔发生的不正常切割而连在噬菌体DNA上,部分缺陷的温和噬菌体,把供体菌的少数特定基因转移到受体菌中,（1）低频转导（LFT）指通过一般溶源菌释放的噬菌体所进行的转导，因其只能形成极少数转导子，故称低频转导。,核染色体组进行不正常切离的频率极低，因此在其裂解物中所含的部分缺陷噬菌体的比例也极低（10-4-10-6），这种含有极少数局限转导噬菌体的裂解物称为低频转导裂解物。用低频转导裂解物在低感染复数条件下感染其宿主，就可获得极少量的局限性转导子。,温和噬菌体裂解时的不正常切割：包含gal或bio基因,缺陷噬菌体DNA分子在宿主细胞内能够象正常的DNA分子一样进行复制、包装，提供所需要的裂解功能，形成转导颗粒，但没有正常噬菌体的溶源性、免疫性和增殖能力，感染受体细胞后，通过DNA整合进宿主染色体而形成稳定的局限转导子。,低频转导,低频转导裂解物,正常噬菌体,极少量的部分缺陷噬菌体（局限转导噬菌体）,转导颗粒,局限转导子（极少量）,低感染复数,局限转导与普遍转导的主要区别：,a）局限转导中被转导的基因共价地与噬菌体DNA连接，与噬菌体DNA一起进行复制、包装以及被导入受体细胞中。而普遍性转导包装的可能全部是宿主菌的基因。,b）局限性转导颗粒携带特定的染色体片段并将固定的个别基因导入受体，故称为局限性转导。而普遍性转导携带的宿主基因具有随机性。,双重溶源菌：同时感染有正常噬菌体和缺陷噬菌体的受体菌。在局限转导中，若对双重溶源菌进行诱导，就会产生含50%左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物，用这种裂解物去转导受体菌，就可获得50%左右的转导子，故称为高频转导。,（2）高频转导,高频转导,低频转导裂解物,正常噬菌体,极少量的部分缺陷噬菌体（局限转导噬菌体）,转导颗粒,三次感染，三次整合，一次切割，两次复制，两次裂解，两次转导,高感染复数,双重溶源菌,缺陷噬菌体和正常噬菌体同步复制,高频转导裂解物,部分缺陷噬菌体（局限转导噬菌体）,正常噬菌体,UV,转导颗粒,局限转导子（大量）,低感染复数,当正常的温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时，因噬菌体基因整合到宿主的核基因组上，而使宿主获得了除免疫性外的新遗传性状的现象，称溶源转变。,3、溶源转变,例：白喉棒杆菌-温和噬菌体,溶源转变是一个与转导相似又不同的现象,溶源转变的特点：噬菌体不携带任何供体菌的基因；噬菌体是完整的，而不是缺陷的；噬菌体基因的整合到宿主染色体上导致宿主获得新性状，没有通过基因重组而形成的稳定转导子；宿主获得新性状具有不稳定性。,（三）接合(conjugation),通过细胞与细胞的直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程。,1946年，JoshuaLederberg和EdwardL.Taturm细菌的多重营养缺陷型杂交实验,中间平板上长出的原养型菌落是两菌株之间发生了遗传交换和重组所致。,证实接合过程需要细胞间的直接接触的“U”型管实验（BernardDavis，1950）,接合机制(大肠杆菌的接合机制),接合作用是由一种被称为F因子的质粒介导。F因子的分子量通常为5107，上面有编码细菌产生性菌毛及控制接合过程进行的20多个基因。,F因子为附加体质粒既可以脱离染色体在细胞内独立存在，也可插入（整合）到染色体上,F因子的四种细胞形式,a）F-菌株(“雌性”菌株)：不含F因子，没有性菌毛，但可以通过接合作用接收F因子而变成F+菌株；b）F+菌株(“雄性”菌株)：F因子独立存在，细胞表面有性菌毛。c）Hfr菌株：F因子插入到染色体DNA上，细胞表面有性菌毛。d）F菌株：Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为F因子。细胞表面同样有性菌毛。,1）F+F-杂交,理化因子的处理可将F因子消除而使F+菌株变成F-菌株,F+菌株的F因子向F-细胞转移，但含F因子的宿主细胞的染色体DNA一般不被转移。,a）F+细菌通过性毛与F-细菌接触并发生相互作用；b）F+细菌的F因子出现缺口，双链之一被切断，从断端转移F因子的一条链到F-细菌中。c）F因子的一条链一进入F-细菌中，就在F-细菌中复制新的F因子。,d）复制完成后，F-细菌变成F+，同时原有F+细胞也完成F因子另一条链的复制，所以转移是F+的拷贝。所以最终杂交的结果是F-细菌变成F+细菌，而原有的F+细菌则不变。,Hfr菌株的F因子插入到染色体DNA上，因此只要发生接合转移转移过程，就可以把部分甚至全部细菌染色体传递给F-细胞并发生重组，由此而得名为高频重组菌株。,2）HfrF-杂交,Hfr菌株仍然保持着F+细胞的特征，具有F性菌毛，并象F+一样与F-细胞进行接合。所不同的是，当OriT序列被缺刻螺旋酶识别而产生缺口后，F因子的先导区(leadingregion)结合着染色体DNA向受体细胞转移。F因子除先导区以外，其余绝大部分是处于转移染色体的末端，由于转移过程常被中断，因此F因子不易转入受体细胞中。HfrF-杂交后的受体细胞(或接合子)大多数仍然是F-。,染色体上越靠近F因子的先导区的基因，进入的机会就越多，在F-中出现重组子的的时间就越早，频率也高。,中断杂交（interruptedmating）技术,利用HfrF-的接合过程，在不同时间取样，并把样品猛烈搅拌以分散接合中的细菌，然后分析受体细菌基因型，以时间(分钟)为单位绘制遗传图谱，该图谱是细菌染色体上基因顺序的直接反映。,大肠杆菌基因组很大（全部转移需要100分钟），其遗传图谱须用多株F因子整合在不同位置的Hfr菌才能完成,3）FF-杂交,Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为F因子。,FF-与F+F-的不同：供体的部分染色体基因随F一起转入受体细胞：a）与染色体发生重组；b）继续存在于F因子上，形成一种部分二倍体；,细胞基因的这种转移过程又常称为性导（sexduction）、F因子转导（F-duction），或F因子媒介的转导（F-mediatedtransduction）。,“接合”“转导”及“转化”这三种在自然界中存在的细菌遗传重组过程各自的特点：,外源DNA的来源及进入途径有差异,（四）原生质体融合,通过人为的方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体进行融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程。,二、真核微生物的基因重组（一）有性杂交,细胞（）细胞（）,有性接合染色体重组新遗传型,能产生有性孢子的酵母菌、霉菌和蕈菌都可以进行有性杂交,（二）准性杂交,细胞（）细胞（）,准性接合基因重组新遗传型,菌丝联结质配核配有丝分裂交换单倍体杂合子,半知菌的准性生殖,类似于有性生殖，但比之