实验6 微柱法分离测定糖化血红蛋白ppt课件

实验十微柱法分离测定糖化血红蛋白,一.目的要求,了解测定糖化血红蛋白的意义。掌握微柱法测定糖化血红蛋白的原理和实验技术。,二实验原理,葡萄糖可以和体内多种蛋白质中的氨基不可逆地以共价键结合，这个过程不需要酶的参与，其反应速度主要取决于葡萄糖的浓度。这种被葡萄糖糖化的蛋白主要存在于糖尿病或其他高血糖患者中。糖化过程通常缓慢地进行，一旦形成，不再解离。对血糖或尿糖波动较大的患者来说，采用糖化蛋白来诊断或追踪病情的发展具有独特的临床意义，它可以反映较长时期以来的平均血糖浓度。,二实验原理,临床上测定的糖化蛋白主要有糖化血红蛋白(glycohemoglubin，GHb)和糖化血清蛋白(glycatedserumprotein，GSP)。测定糖化蛋白的方法有比色法、电泳法、等电聚焦法、离子交换层析法、高效液相层析法、亲和层析法、免疫化学法、毛细管电泳法等。国内以比色法、离子交换层析法及电泳法较常用。,二实验原理,带负电荷的Bio-Rex70阳离子交换树脂与带正电荷的HbA及HbAi有亲和力，但由于HbAi的两个链N-末端正电荷被糖基清除，正电荷较HbA少，二者对树脂的亲和力不同。用pH6.7磷酸盐缓冲液可首先将带正电荷较少、吸附力较弱的HbA1洗脱下来，再用分光光度计测定洗脱液中的HbA1占总Hb的百分数。,三器材及试剂,1器材：（1）塑料微柱。（2）紫外-可见分光光度计。,三器材及试剂,2试剂：（1）0.2mol/L磷酸氢二钠溶液：称取无水磷酸氢二钠28.369g，溶于蒸馏水中并定容至1L。（2）0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：称取NaH2PO42H2O31.206g，溶于蒸馏水中并加1L。（3）溶血剂：取试剂（2）25ml，加TritonX-100100mg，加蒸馏水至100ml。（4）磷酸盐缓冲液(pH6.7)：取试剂（1）100ml、试剂（2）150ml，加蒸馏水至1L。（5）磷酸盐缓冲液(pH6.4)：取试剂（1）300ml、试剂（2）700ml，加蒸馏水300ml，混匀即成。（6）Bio-Rex70阳离子交换树脂，200400目，钠型，分析纯级。,四操作步骤,1树脂处理称取树脂4g，加0.1mol/L氢氧化钠溶液15ml，搅匀，置室温30min，间隔搅拌2-3次。然后加浓盐酸数滴，调至pH6.7，弃去上清液。用蒸馏水约25ml洗1次，再用试剂（5）10ml洗2次，最后用试剂（4）洗4次即可。2装柱树脂加试剂（4）搅匀，用毛细滴管加入塑料微柱内，使树脂床高度达3-4cm即可，树脂床应均匀，无气泡、无断层才可。3血红蛋白溶液的制备取EDTA抗凝血或毛细管血20L，加入2.0mL生理盐水中，摇匀，2000rpm离心5分钟，弃上清液，仅留下细胞。加溶血剂0.3ml，摇匀，置37水浴中15min，以除去不稳定的HbA1。,四操作步骤,4柱的准备将微柱摇动使树脂混悬，然后去掉上下盖，将柱插入1.5cmx15cm的试管中，让柱内缓冲液完全流出。5上样用微量加样器取血红蛋白溶液100l，加至微柱内树脂床上，待其完全进入树脂床后，将柱移入另一支1.5cmx15cm的试管中。6洗脱取试剂（4）3ml缓缓加至树脂床上，注意勿冲动树脂。收集洗脱液，此即为HbA1（测定）。,四操作步骤,7对照取上述血红蛋白溶液50L，加蒸馏水7.5ml，摇匀，此即为总Hb管。8比色以蒸馏水作空白，415nm波长，测定各管吸光度。9柱的清洗用过的柱先加试剂（5）3ml，使Hb全部洗下，再用试剂（4）洗3次，每次3ml。最后加试剂（4）3ml，加上下盖，保存备用。,五计算,参考值HbAl:6.590.69%,六临床意义,糖化血红蛋白测定用于评定糖尿病的控制程度，当糖尿病控制不佳时，糖化血红蛋白浓度可高至正常2倍以上。因为糖化血红蛋白是血红蛋白生成后与糖类经非酶促结合而成的。它的合成过程是缓慢的，而且是相对不可逆的，持续于红细胞120天生命期中，其合成速率与红细胞所处环境中糖的浓度成正比。因此，糖化血红蛋白所占比率能反映测定前1-2个月内平均血糖水平，现已成为反映糖尿病较长时间血糖控制水平的良好指标。,七注意事项,1层析时一般在28较为适宜，冬季应将柱置于28温箱中洗脱。2HbA1不能和HbF、HbH及HbBarts分开，有前述异常血红蛋白病者不宜用此方法。3标本