培养基的配制

1、了解培养基的概念、种类和用途，明确培养基的配制原理。2、学习掌握培养基配制的一般方法和步骤。3、掌握高压蒸汽灭菌的方法步骤。,实验目的,培养基的配制,培养基(culturemedium)是指人工配制的、适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。自然界中微生物种类繁多，营养类型多样，加之实验和研究目的不同，所以培养基的种类很多，不同种类的培养基一般都应含有微生物生长所需的碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子和水六大营养要素，且各成分比例应合适。为了满足微生物生长繁殖或积累代谢产物的要求，还必须控制培养基合适的pH。,实验原理,.,牛肉膏蛋白胨培养基,牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，含有牛肉膏、蛋白胨和NaCl。其中牛肉膏为微生物提供碳源、能源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源和维生素，而NaCL提供无机盐。琼脂在常用浓度下96时溶化，在40时凝固，通常不被微生物分解利用。固体培养基中琼脂的含量根据琼脂的质量和气温的不同而有所不同。,常用培养基：牛肉膏蛋白胨培养基广泛用于细菌的培养；高氏一号培养基用于培养放线菌；马铃薯葡萄糖培养基被广泛用于培养霉菌。常用凝固剂是琼脂，固体培养基琼脂加量通常为1.5%-2%；半固体培养基琼脂加量为0.5%-0.8%。,实验分组安排,4-5人一组配制牛肉膏蛋白胨固体培养基400mL马铃薯糖琼脂培养基200mL淀粉琼脂培养基（高氏培养基）200mL平皿30个99mL无菌水装三角瓶6瓶9mL无菌水试管装12支1mL吸管15支牛肉膏蛋白胨固体培养基斜面5支,.,牛肉膏蛋白胨培养基配方：,牛肉膏3g蛋白胨10gNaCl5g琼脂15-20g水1000mlpH7.4-7.6,.,淀粉琼脂培养基（高氏培养基）：,可溶性淀粉20g硝酸钾1g磷酸氢二钾0.5gNaCl0.5g硫酸镁0.5g硫酸亚铁0.01克琼脂15-20g水1000mlpH7.2-7.4,.,马铃薯蔗糖琼脂培养基：,把马铃薯洗净去皮，取200克切成小块，加水1000毫升，煮沸半小时后，补足水分。在滤液中加入15克琼脂，煮沸溶解后加蔗糖20克补足水分pH值调到7.27.4,1、称量及溶化,2、调pH,3、加琼脂、溶化、定容、（过滤）,4、分装、加塞、包扎,5、灭菌,6、摆斜面,操作步骤,称量与溶化：,注意：1）牛肉膏的称取：用玻璃棒蘸取适量牛肉膏，抹于称量纸上，勿取过量，不足时，再蘸取少量，逐步添加；然后将牛肉膏连同称量纸放入水中，稍等片刻牛肉膏即从称量纸上脱落，用玻璃棒将纸捞出即可。,操作步骤(continued),.,称量与溶化：,注意：2）蛋白胨很易吸湿，在称取时动作要迅速。另外，称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净，擦干，再称取另一药品瓶盖也不要盖错。,操作步骤(continued),.,调pH值：,在未调pH值前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/LNaOH边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH，直至pH达要求。反之，用1mol/LHCl进行调节。,操作步骤(continued),加琼脂、溶化、定容、（过滤）,琼脂一般应在调好了pH后加入，琼脂的加入不会影响培养基的pH。琼脂加入后应煮沸数分钟，以使其完全溶化，否则易出现分布不均，导致部分斜面不凝固或过软，另外部分则琼脂过多。加热过程中因水分蒸发而可能使培养基体积减小，应补充水分至所需量。,操作步骤(continued),分装：,1）装量：液体试管高度的1/4左右固体试管高度的1/5，灭菌后摆斜面半固体一般为试管高度的1/3，灭菌后垂直放置,操作步骤(continued),棉塞制作方法：,加塞：棉塞或硅胶塞作用：防止外界微生物进入培养基内造成污染，并保证有良好的通气性能。,包扎：,加塞后，试管通常每7支一起，包上一层牛皮纸或两层报纸，用线绳扎紧。三角瓶加塞后也用牛皮纸包扎。以活结形式扎紧，以便使用时容易解开。用记号笔注明培养基名称、配制日期、配制人或实验组。,操作步骤(continued),灭菌时包牛皮纸,灭菌：,培养基灭菌一般采用压力蒸汽灭菌通常灭菌条件为1.05kg/cm2,121灭菌20分钟；含糖量高的培养基，则为0.56kg/cm2,115灭菌30分钟。,操作步骤(continued),摆斜面：,成扎摆放，不需将每支试管单独摆放最好待培养基冷至60时摆斜面，以免形成大量冷凝水,无菌检查：,将灭菌的培养基放在37温箱中培养24-48小时，以检查灭菌是否彻底。,二消毒与灭菌,加热法,干热法湿热法,火焰烧灼热空气灭菌,压力蒸汽灭菌间歇灭菌煮沸灭菌巴斯德消毒,实验原理,1、了解掌握常用消毒、灭菌方法的原理。2、学习掌握干热灭菌和压力蒸汽灭菌操作步骤。,实验目的,滤膜过滤器的滤膜是一种多孔纤维素，孔径一般为0.45um，过滤时，液体和小分子物质通过，细菌被截流在滤膜上。,过滤除菌许多材料，如血清、糖溶液等，用一般加热消毒灭菌方法，均会被热破坏，应采用过滤除菌。应用最广的过滤器有蔡氏(Seitz)过滤器和膜过滤器。,紫外线灭菌紫外线波长在200-300nm,具有杀菌作用，其中以265-266nm杀菌力最强。无菌室或无菌接种箱空气可用紫外线灯照射灭菌。,实验原理(continued),干热灭菌,电烤箱,实验内容及实验步骤1、干热灭菌2、压力蒸汽灭菌,干热灭菌,1、装入待灭菌物品2、升温接通电源，加热升温至160-170。3、恒温保持160-1702小时。4、降温切断电源，自然降温。5、开箱取物待烤箱温度降到70以下以后，方可打开箱门，取出物品。箱内温度高于70，切勿自行打开箱门，以免玻璃器皿炸裂。,实验内容及实验步骤(continued),实验内容及实验步骤(continued),压力蒸汽灭菌,压力蒸汽灭菌,1、检查水位，放入物品。