细胞凋亡和细胞自噬201XPPT课件

.,史娟医科院基础所新科研楼607E-mail:shijuantt,细胞凋亡和细胞自噬,.,.,Outline,1.Historyofapoptosisresearch2.Characterizationofapoptosis3.PhysiologicalSignificances4.ApoptosisSignalingPathways5.RegulationofApoptosis6.ApoptosisandAutophagy,.,第一节凋亡的研究历史,1842CarlVogetInitialobservationthatcelldeathinpartofnormaldevelopment1972Kerr,WyllieandCurrie-introducedtermapoptosistodescribecelldeathwithasetofcommonmorphologicalfeatures-Celldeletionwascontrolledunderphysiologicalconditionsinadults-Deregulationcouldleadtomanydiseases-MorphologicallyidenticaltodevelopmentalCDanddistinctfromaccidentalcelldeath,.,1980WyllieBiochemicalchangesinapoptoticmorphology:-DNAfragmentation-Requiresexpressionofdeathgenes1988Bcl-2wasfoundtobeanti-apoptotic1991cedgeneswereidentifiedinC.elegan1992Fas/APO-1/CD95wasidentified1993Aroleofp53inregulationofapoptosiswasdescribedFasligandwasidentifiedICEwasfoundtobehomologofced-3inmammalianIAPswereidentified1994Theroleofmitochondriaduringapoptosis1996TheroleofcaspasesduringapoptosisReleaseofcytochromecfrommitochondriaduringapoptosiswasdiscovered1997Apafswereidentified,.,NobelPrize2002inPhysiologyandMedicine,SydneyBrennerJohnE.SulstonRobertH.Horvitz,fortheirdiscoveriesconcerninggeneticregulationoforgandevelopmentandprogrammedcelldeath,.,“GeneticcontrolofprogrammedcelldeathinthenematodeCaenorhabditiselegans”,“Youcanobservealotbywatching.”Y.Berra,.,第二节凋亡细胞的特征,.,凋亡(apoptosis)的形态学特征为染色质凝集、边缘化，细胞皱缩，细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸外翻，细胞出泡形成凋亡小体。细胞凋亡受到一系列相关基因的严格调控。程序性细胞死亡（programmedcelldeath，PCD），即是指细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，主动结束其生命的过程，这种死亡由基因决定的。大多数程序性细胞死亡，呈现细胞凋亡的形态学特征。,.,Necrosis,Apoptosis,.,细胞凋亡与细胞坏死在形态上的主要区别,细胞凋亡细胞坏死,发生条件多为生理性病理性（偶然刺激）单个细胞丢失成群细胞死亡细胞膜发泡，完整破裂，不完整细胞器结构保留破坏细胞核核凝集断裂核破碎溶解染色质均一浓缩细胞皱缩形成凋亡小体细胞膨胀而溶解被邻近正常和巨噬细胞吞噬残余碎片被巨噬细胞吞噬炎症反应无，不释放内容物有，释放内容物,.,细胞凋亡与细胞坏死在生物化学方面的主要区别,细胞凋亡细胞坏死,基因调节由凋亡相关基因调控与基因调控无关发生条件多为生理性病理性（偶然刺激）能量需要能量不需要能量新的基因转录有无大分子合成需要不需要Caspase依赖性不依赖DNA降解为180-200bpDNA随机性降解成为任意的整数倍的DNALadder长度的片段细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻,.,MorphologyofApoptoticCell,.,Apoptosis,Necrosis,ApoptosisVS.Necrosis,.,.,第三节细胞凋亡的生理学病理学意义,.,保证个体正常发育：蝌蚪成蛙、昆虫蜕变、淋巴细胞阳性和阴性选择、表皮和指（趾）甲的形成等。维持内环境稳定：清除衰老细胞、DNA损伤的细胞等。如果机体对受损、突变或者衰老的细胞不能及时清除话，就会干扰内环境稳定。防御功能：清除被病原体感染的细胞等。,生理学意义,.,保证个体正常发育：蝌蚪成蛙、昆虫蜕变、淋巴细胞阳性和阴性选择、表皮和指（趾）甲的形成等。,.,Sculptingthedigitsinthedevelopingmousepawbyapoptosis.,Tissueremodeling.,.,脊椎动物的神经系统的发育,.,CTL杀伤靶细胞。,.,免疫细胞凋亡,细胞凋亡:95%的细胞凋亡胸腺细胞成熟过程中的凋亡阳性选择阴性选择激活诱导的细胞凋亡：（activation-inducedcelldeath，AICD）CTL诱导靶细胞的凋亡：穿孔素介导的靶细胞凋亡Fas介导的靶细胞凋亡,.,lymphoidprogenitor(CLP)doublenegative(DN)doublepositive(DP),ApoptosisandsurvivalduringTlymphocytedevelopment,.,ApoptosisandsurvivalduringBlymphocytedevelopment,.,物理因素：X-射线、热休克等；化学因素：过氧化氢、乙醇、8氯腺苷、氨甲蝶呤、苯丁酸氮芥、三尖杉酯碱等；生物因素：某些细胞因子表达水平变化、蛋白分子的激活、修饰、降解或构象改变、活性氧的产生等。,ApoptosisInducers,.,病原体侵染；诱导凋亡HIV抑制凋亡Poxvirus细胞凋亡不足肿瘤，自身免疫疾病；细胞凋亡过度神经退行性疾病（AD，帕金森症）、心肌梗塞、再生障碍性贫血、骨组织坏死。,病理学意义,.,HIVinfectioncausesapoptosis,.,第四节细胞凋亡的信号传递,.,细胞外部刺激信号介导的死亡受体信号传递途径(extrinsic)细胞内部的信号传递途径(intrinsicormitochondrial),.,连接分子（adaptor）：具有一些特殊的功能结构域，如DD、DED、CARD等，同种结构域间具有相互结合的倾向,.,TheTNFandTNFRsuperfamilies,AggarwalBB。NatRevImmunol.2003，3(9):745-56,.,CRD：Cys-richrepeatsextracellularDD：deathdomaincytoplasmicessential,.,.,StructureofDeathReceptors,胞外区结构相似，有多个富含半胱氨酸保守序列；胞内区均有特殊死亡功能区（约90个氨基酸残基组成的基序,deathdomain,DD）；死亡功能区无任何酶活性，但可与具有相似死亡结构域的蛋白结合。,.,MechanismsofTRAILFunctioning,Twofunctionaldeathreceptors(DR4/DR5)Threedecoyreceptors(DcR1,DcR2457(7232):981-9.,.,Caspase1ICECaspase2ICH-1/Nedd-2Caspase3CPP32/YamaCaspase4TXICH-2ICErelIICaspase5ICErelIIITyCaspase6Mch-2Caspase7Mch-3Caspase8MACHFLICEMch-5Caspase9ICE/LAP6Mch-6Caspase10Mch-4FLICE-2Caspase11ICH3Caspase12ERapoptosis-specificCaspase13ERICECaspase14MICECaspase15Caspase16Caspase17Caspase18,Caspases:cysteineasparticacidspecificprotease“C”=cysteine,“asp”=cleaveafterAsp;familyofproteaseswithsimilaraminoacidsequence,structure,substratespecificity,.,根据Caspase家族成员之间大小亚单位的同源性,可将他们分为3组:炎症组（inflammatorymediators）:Caspase1,4,5,12,13,14凋亡起始组（apoptoticinitiators）：Caspase2,8,9,10凋亡效应组（apoptoticexecutioners）：Caspase3,6,7,DED:deatheffectordomainCARD:caspaserecruitmentdomain,.,StructureandFunctionofCaspases,DED:deatheffectordomainsCARD:caspaserecruitmentdomains,.,Caspasesareproducedaszymogens,LavrikIN,JClinInvest.2005;115:2665-72,.,Schemeofprocaspase-8processingattheCD95DISC,LavrikIN,JClinInvest.2005;115:2665-72,.,MechanismsofCaspaseActivation,自活化(autoactivation)是指部分Caspase酶原具有在高浓度或局部高浓度时形成寡聚复合体可自身激活自身的特性。主要为凋亡起始组成员,。转活化（transactivation）是已激活的起始Caspase激活其它Caspase酶原的方式。非Caspase蛋白酶活化是Caspase酶原激活的另一方式。例如GranzymeB。,.,Activationmodelofcaspases,.,Howcaspaseskill,ICADb.DirectinhibitionofcaspaseactivitythroughactivesitenitrosylationBcl-2proteinfamily:pro-vs.anti-;Caspaseinhibitors:a.痘苗病毒CrmAandp35;b.FLIPs;c.IAPs,.,DualFunctionsofCaspase-8,Expressionandphosphorylationstateofcaspase-8intumors:prognosticmarkerortopharmacologicallystimulatecaspase-8processingfortumortherapy,FrischSMCancerRes2008;68:4491-3,.,SignalTransductionbydeathreceptors,AshkenaziA.NatRevCancer.2002;2(6):420-30,.,ImmunolCellBiol(2006)84,8798,.,IntrinsicSignalingPathwayActivationrequires:-Cytochromecrelease-ATP/dATP-Apaf-1-Cytc/Apaf-1/procaspase-9/ATP(dATP)apoptosome-Caspase-9activation,ExtrinsicSignalingPathwayActivationrequires:-deathreceptor-adaptorproteins(FADD/TRADD)-DISC(death-inducingsignalingcomplex)-Caspase-8/10activation,.,Centralroleofmitochondriainapoptosis,-线粒体跨膜通道(permeabilitytransitionpore,PT孔)的开放-线粒体跨膜电位下降，Cytc释放-Cytc/Apaf-1/procaspase-9/dATPapoptosome-Caspase级联-Smac释放,.,StructureofApaf-1,Apaf-1:apoptoticproteaseactivatingfactor-1,.,.,Inflammasomeininflammation,.,.,Finkel,Science.2001;292(5517):624-626.,线粒体PT孔主要由位于内膜的腺苷转位因子ANT和位于外膜的电压依赖性阴离子通道VDAC等蛋白所组成，PT孔开放会引起线粒体跨膜电位下降和cytc、凋亡因子AIF等释放。Bcl-2家族蛋白对于PT孔的开放和关闭起关键的调节作用，促凋亡蛋白Bax等可以通过与ANT或VDAC的结合介导PT孔的开放，而抗凋亡类蛋白如Bcl-2、Bcl-xL等则可通过与Bax竞争性地与ANT结合，或者直接阻止Bax与ANT、VDAC的结合来发挥其抗凋亡效应。,.,Synergismbetweenextrinsicandintrinsicdeathpathwaysbycaspase-processedBid,Cross-talkandintegrationbetweendeath-receptorandmitochondrialpathwaysUndersomeconditionscross-talkisminimalthetwopathwaysoperateindependentlyCaspaseprocessingofBidinducestranslocationofprocessedBidtomito,whereitpromotescytochromecrelease,Hengartner,Nature407:770,2000,.,.,StefanJ.RiedlNatureReviewsMolecularCellBiology5,897-907,PathwaystocelldeathinC.elegans,Fruitfliesandmammals,.,Bcl-2基因家族IAP家族FLIP家族其他：HSP、NF-kBP53,第五节细胞凋亡的基因表达调控,.,.,ApoptosisRegulatorsinBcl-2Family,.,Bcl-2亚家族：抑制细胞凋亡的发生，结构上拥有保守的BH1BH4的结构域和跨膜区,BH1与BH2结构域是抗凋亡蛋白必备的结构域，同时在同源或异源性二聚体和离子通道的形成中发挥重要的作用，主要包括Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-W和Mcl-1等；Bax亚家族：促进细胞凋亡，结构上缺乏BH4结构域，只含BH1BH3和跨膜区，包括Bax、Bak、Bok；BH3亚家族：促进细胞凋亡，结构上仅具有1个保守的BH3同源结构域，主要包括Bad、Bim、Bid和Bik等。,StructureandFunctionofBcl-2FamilyProteins,ValentijnAJ,BiochemSocTrans.2004;32(Pt3):421-5,.,Bcl-2family-mediatedapoptosis,Antiapoptoticmembers:BCL-2,BCL-XL,A1,MCL-1,etc.Proapoptotics:BID,BAD,BIM,BIK,BMF,NOXA,PUMA,etc.,.,ModelsforinteractionbetweenBH3-onlyproteins,BAX/BAK-likeproteinsandpro-survivalBCL-2-familymembersinsignallinginapoptosis.,StrasserA.NatRevImmunol.2005;5(3):189-200.,.,Smallmoleculesconvertanti-deathfactorsintopro-deathfactors,naturechemicalbiology200812(4):722,.,.,Inhibitorsofapoptosisproteins(IAPs),IAP(XIAP,c-IAP-1,c-IAP-2,Survivin,Livin):tobindwithpro-caspaseandinhibittheactivationofcaspases;IAPinhibitors：Smac/DIABLO(secondmitochondria-derivedactivatorofcaspase/directIAP-bindingproteinwithlowpH),tobindwithIAPsandactivatecaspase-9Omi/HtrA2,.,StructureofBIRdomain-containingIAPs,RiedlSJ,NatRevMolCellBiol.2004;5(11):897-907.,BIR一般由80个氨基酸残基构成,全称为杆状病毒IAP重复序列(baculoviralIAPrepeat),为IAP抑制细胞凋亡所必需的，也是所有IAP家族蛋白共有的结构域。事实上含BIR结构域的蛋白质在许多真核生物中都可以见到，但并不是所有含BIR结构域的蛋白都能够抑制凋亡。RING结构是存在于部分IAP蛋白羧基末端的锌指样结构单元。这种锌指样结构具泛素酶活性,能够促进caspase的降解,参与凋亡抑制作用。少数IAP分子存在CARD结构,是位于IAP分子BIR结构和锌指结构之间的一段序列,目前尚未证明CARD结构与抑制凋亡有关。,.,MolecularmechanismofIAP-mediatedinhibitionofeffectorcaspases.,ReialSJetal.,NatRevMolCellBiol.2004Nov;5(11):897-907.,.,theMultiplemechanismsofIAPs,JesenbergerV,NatRevMolCellBiol.2002;3(2):112-21,.,KrammerPH,NatRevImmunol.2007;7(7):532-42.,StructureofcFLIP(FLICEinhibitorprotein)family,DEDdomain,.,RegulationofNF-kBactivationbycFLIP,.,MathewR,ClinCancerRes.2006;12(12):3648-51.,.,RegulationofNF-kBoncellsurvivalandapoptosis,.,热激蛋白(heatshockprotein，HSP),除参与细胞内一些重要蛋白质分子的构象、稳定性及激酶活性调节之外，HSP另一重要生理功能是对应激状态下的细胞提供保护。近年来的研究证实HSP蛋白家族的重要成员如HSP90、HSP70及HSP27等可以直接作用于细胞的抗凋亡机制,.,JClinInvest.2005;115(10):26332639.,HSPandapoptosis,.,P53460(7254):529-33.,ModulationofmicroRNAprocessingbyp53,P53WTp53-/-aftertreatmentfor8or24hwith0.2gml-1doxorubicin,.,RegulationofmiRNAbiosynthesisbyp53,HeikoHermeking,NatureReviewsCancer2012,12,613-626,.,Regulationofp53pathwaybymiRNAnetwork,.,ApoptoticsignallingpathwaysandtheinvolvementofmiRNAregulation,.,.,.,.,细胞凋亡的检测,.,针对凋亡不同阶段特征的检测方法,1早期检测PS(磷脂酰丝氨酸)在细胞外膜上的检测细胞内氧化还原状态改变的检测细胞色素C的定位检测线粒体膜电位变化的检测2晚期检测TUNEL（Terminaldeoxynucleotidyltransferase-mediateddUTPnick-end-labeling）LM-PCRLadder(连接介导的PCR检测)TelemeraseDetection(端粒酶检测)3mRNA水平的检测,.,针对不同位置的凋亡特征的检测方法,细胞凋亡的形态学检测方法凋亡细胞的光学显微镜和倒置显微镜观察凋亡细胞的荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜观察凋亡细胞的电子显微镜观察细胞膜相关凋亡检测线粒体相关凋亡检测胞浆蛋白相关凋亡检测Caspase(半胱天冬氨酸酶)活性检测凋亡相关的非Caspase蛋白酶检测胞浆其他蛋白活性检测细胞核相关凋亡检测其他,.,细胞凋亡的检测方法简述,一、细胞凋亡的形态学检测二、磷脂酰丝氨酸外翻分析（AnnexinV法）三、DNA片断化检测四、TUNEL法五、Caspase-3活性的检测六、WB检测,.,MorphologyofApoptoticCell,凋亡诱导剂诱导人肺癌细胞株A549发生凋亡，hoechst33258染色,.,DNAfragmentationandtheappearanceof“DNAladder”,.,.,2,.,.,ApoptoticHeLacellswerestainedwithFITC-AnnexinV+PI,.,AnnexinV-FITCFluorescence,PIFluorescence,TimecourseofapoptosisinTF-1cellsculturedinGM-CSF-freemedium,.,.,.,.,.,.,第六节凋亡与自噬,.,VariousModelsofCellDeath,.,Classificationofcelldeathaccordingtothenuclearmorphologyofthedyingcell,NatureImmunology4,416-423(2003),.,Classificationofcelldeathaccordingtocaspaseactivation,NecrosisCDCD:Apoptosis,MitoticCatastrophe,ModelofApoptosis-like,AnoikisCICD:Autophagy,Paraptosis,Oncosis,ModelofNecrosis-like,.,ApoptosisandAutophagy,自噬（autophagy）：就其本义而言就是自己吃自己，指细胞在营养缺乏时靠消化自身细胞器而获得能量以度过饥荒的行为。然而，在后来的研究中发现自噬并不只是细胞的一个生存策略，同时也是细胞死亡的一种方式。如在Parkinsons和Alzheimers疾病病变的细胞中，经常可以看到细胞自噬的现象。自噬则是利用溶酶体对细胞自身体内的部分细胞质和细胞器进行一系列降解的过程。它的显著特征是形成大量自体吞噬小泡。自噬过程中的细胞骨架虽然解聚，但并不像凋亡过程那样发生明显的细胞骨架降解。,“self-killing”“self-eating”,.,JClinInvest.2005Oct;115(10):2679-88.,.,自噬现象最早在哺乳动物中的研究是由Ashford和Porten于1962年通过电子显微镜在人的肝细胞中观察到，但直到1997年日本科学家YoshinoriOhsumi小组在酵母菌中发现自噬相关基因（autophagyrelatedgene,Atg），对自噬的研究才有新的进展。,.,诱导细胞发生自噬的因素：饥饿、生长因子缺乏、微生物感染、细胞器损伤、蛋白质折叠错误或聚集、DNA损伤、放疗、化疗等等,.,自噬的特性：1）自噬是细胞消化掉自身的一部分，初一看似乎对细胞不利。事实上，细胞正常情况下很少发生自噬，除非有诱发因素的存在。细胞外的：如外界中的营养成分、缺血缺氧、生长因子的浓度等细胞内的：代谢压力、衰老或破损的细胞器、折叠错误或聚集的蛋白质等由于这些因素的经常性存在，因此细胞保持了一种很低的基础的自噬活性以维持自稳。2）自噬过程很快，被诱导后8min即可观察到自噬体形成，2h后自噬溶酶体基本降解消失。这有利于细胞快速适应恶劣环境。3）自噬的可诱导特性：表现在2个方面，第一是自噬相关蛋白的快速合成，这是准备阶段。第二是自噬体的快速大量形成，这是执行阶段。4）批量降解：这是与蛋白酶体降解途径的显著区别5）自噬的保守性：由于自噬有利于细胞的存活，因此无论是物种间、还是各细胞类型之间，自噬都普遍被保留下来。,.,.,Autophagypathwayanditsroleincellularadaptationtonutrientdeprivation,LevineB,Nature.2007;446(7137):745-7.,.,RegulationoftheAutophagicPathway,.,AutophagyinHealthandDisease,.,自噬和肿瘤双刃剑,与凋亡（在肿瘤细胞中一般都存在缺限）不同，自噬是被优先保留的。自噬基因敲除的动物自发肿瘤增多，相反自噬基因敲除后，增加了化疗、放疗、免疫治疗的敏感性。,.,自噬与肿瘤,1）肿瘤细胞本身就具有高代谢的特点，对营养和能量的需求比正常细胞更高，但肿瘤微环境往往不能如意，如肿瘤发生初始期到血管发生之前、肿瘤长大发生血管崩塌时、肿瘤细胞脱离原发灶游走时等都会出现营养不足或供应中断，而此时提高自噬活性可以有助于度过这一危机。2）当化疗、放疗后，肿瘤细胞会产生大量的破损细胞器、损坏的蛋白质等有害成分，而此时提高自噬活性可及时清除这些有害物质，并提供应急的底物和能量为修复受损DNA赢得时间和条件。3）由于自噬减少了肿瘤细胞在代谢应激时发生坏死的机会，而对于肿瘤细胞群体而言，需要一部分细胞发生坏死，以引发适度的炎症（有利于血管的长入、吸引免疫细胞分泌生长因子等）。研究发现，很多类型的肿瘤在代谢应激时会“组成性”活化PI3K信号以抑制自噬。,.,对不同的细胞，自噬的作用可能不同。相同的细胞在不同的外部因素作用时，自噬的作用可能不同。在肿瘤发生发展的不同阶段，自噬的作用可能不同。肿瘤生长的早期阶段自噬增强，是由于此时肿瘤的血管化作用不足，癌细胞的营养供给有限，需要通过自噬为自身提供营养。肿瘤进入发展阶段后基因变异积累，使包括Beclin1在内的众多抑癌基因失活，自噬活力降低。对单个细胞和对整个肿瘤阻滞的作用可能不同。自噬功能不全的细胞易于坏死，但是坏死组织产生的细胞因子（包括部分生长因子）反而会促进肿瘤的生长。,自噬与肿瘤的双重关系,.,Conflictingeffectsofautophagyoncancer,LevineB,Nature.2007;446(7137):745-7.,.,Immune-relatedautophagyfun